[发明专利]一种酶法制备单糖基甘草次酸半乳糖苷衍生物的方法

说明书

本发明克隆了来自植物大豆的糖基转移酶基因GmSGT2，并在大肠杆菌中异源表达糖基转移酶GmSGT2。在pH 7.5、温度35℃条件下，以尿苷二磷酸半乳糖为糖基供体，GmSGT2可以转移1分子半乳糖到3‑O‑葡萄糖醛酸基甘草次酸(GAMG)和3‑O‑葡萄糖基甘草次酸(GLMG)，高效合成Gal‑GAMG和Gal‑GLMG。进一步克隆来自植物大豆的蔗糖合酶基因GmSusy和来自大肠杆菌的UDP‑葡萄糖‑4‑差向异构酶基因GalE，并在大肠杆菌中异源表达蔗糖合酶GmSusy和UDP‑葡萄糖‑4‑差向异构酶GalE。以GmSGT2偶联GmSusy和GalE构建含有UDP循环的多酶体系，在pH 7.0、温度40℃条件下，以尿苷二磷酸及蔗糖为底物，可以转移1分子半乳糖到GAMG和GLMG，实现高效、低成本合成Gal‑GAMG和Gal‑GLMG。

技术领域：

本发明涉及一种合成2-O-半乳糖基-3-O-葡萄糖醛酸基甘草次酸(Gal-GAMG)和2-O-半乳糖基-3-O-葡萄糖基甘草次酸(Gal-GLMG)的方法，属于生物工程与技术领域。

背景技术：

甘草次酸是来源于甘草的五环三萜化合物，主要来源于植物甘草的根茎。甘草次酸因具抗炎抗菌、抗肿瘤、抗病毒等诸多药理作用被广泛应用于医药行业，此外，甘草次酸能够作为药物靶向载体将药物运送到肝细胞膜等某些特定部位，甘草次酸与肝细胞结合还能够抑制肝脏细胞的坏死和凋亡。虽然甘草次酸具有众多良好的生理和药理活性，但长期服用也会对人体产生如假性醛固酮增多症、低钾血症以及高血压等副作用，表现为钠潴留、钾排泄量增加，引起水肿、高血压、四肢瘫痪和低血钾症等一系列症状。此外，甘草次酸在水溶液中的溶解性较差，且在高浓度时对正常细胞存在一定的毒性。因此，以甘草次酸为前体开发低毒性、高药效的甘草次酸衍生物类药物受到广泛关注。

糖基化修饰作为天然产物改性的重要手段被广泛应用，例如，经半乳糖基修饰的半乳糖苷衍生物的水溶性、药物靶向性和抗肿瘤、抗病毒等药理活性都优于母体化合物。目前利用糖基转移酶合成的甘草次酸糖苷衍生物多为单糖基修饰且修饰的糖基类型比较单一，如3-O-单葡萄糖醛酸基甘草次酸(GAMG)和3-O-单葡萄糖基甘草次酸(GLMG)等，实现二糖及以上甘草次酸糖基化修饰的糖基转移酶十分少见，限制了甘草次酸糖苷衍生物的多样性。

现有的对甘草次酸的糖基化修饰多为化学法，先对甘草次酸和糖基先进行基团保护修饰，再通过有机合成方法合成含有糖配基的甘草次酸糖基衍生物。整个反应过程条件苛刻，步骤繁琐，耗时耗能且效率低下，并且使用和产生大量有毒有害试剂，造成环境污染。酶法合成甘草次酸糖苷衍生物有效克服了利用传统化学法合成的缺点，酶法催化效率高，反应条件温和及环境友好等特点，且酶法催化的定向性好，能够直接将糖基供体中的糖基连接至甘草次酸及其糖苷衍生物分子上，后期容易对产物进行分离。

此外，糖基转移酶多以昂贵且不易获得的尿苷二磷酸-糖(UDP-糖)为底物，这阻碍了糖基转移酶和甘草次酸糖苷衍生物的拓展及应用。目前合成UDP-糖的方法多为化学法，化学法工艺复杂，条件苛刻，效率低下，环境不友好且难以合成UDP-半乳糖等多种UDP-糖基供体，而酶法以其定向性好，反应条件温和，环境友好和产物多样等优点避免了传统化学法带来的问题。利用差向异构酶偶联蔗糖合酶以廉价的蔗糖为底物能够高效合成多种UDP-糖，进一步偶联蔗糖合酶构建UDP循环系统不仅能够大大降低甘草次酸糖苷衍生物的合成成本，同时能够有效移除反应过程中UDP的积累对糖基转移酶催化作用的抑制，从而显著提高催化反应效率。

目前通过酶法合成半乳糖基甘草次酸糖苷衍生物的糖基转移酶还未见发掘，利用UDP循环高效合成甘草次酸糖苷衍生物的方法还未见报道。

发明内容：

第一方面，本发明提供了一种转半乳糖基合成Gal-GAMG及Gal-GLMG的糖基转移酶及其编码的基因，该基因是来源于大豆Glycine max的糖基转移酶基因GmSGT2，该基因编码的糖基转移酶为GmSGT2蛋白。所述蛋白的基因序列为SEQ ID NO:1，氨基酸序列为SEQ IDNO:2。