[发明专利]一种人源四次跨膜超家族蛋白12的大胞外片段TSPAN12-LEL制备方法

权利要求书

1.一种TSPAN12蛋白LEL片段制备方法，其特征在于，

包括以下步骤：

（1）将含有TSPAN12蛋白LEL片段的编码序列的重组质粒，经PCR扩增出TSPAN12蛋白LEL片段的编码序列；

（2）将步骤（1）扩增出的片段和包含有麦芽糖结合蛋白编码序列的pMal质粒用限制性内切酶BamH I和HindIII酶切处理，用DNA纯化回收试剂盒回收目的片段后，用T4连接酶于2-37℃连接4~16 h；

（3）将步骤（2）连接产物转化至大肠杆菌克隆菌株中，然后涂布于含氨苄青霉素的LB平板中，36-38℃培养12-24h，挑选单菌落测序验证TSPAN12蛋白LEL片段的编码序列成功连接至pMal质粒，从而获得TSPAN12 LEL的重组表达质粒pMal-TSPAN12 LEL；

（4）将步骤（3）得到的重组表达质粒转化至表达宿主中，然后涂布于含氨苄青霉素的LB平板中，于36-38℃培养12-24h；挑取单菌落用LB培养基培养至光密度值为0.4-0.6时，加入终浓度为0.1~1.0 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷诱导表达；诱导表达结束后，将菌液在高速冷冻离心机中，离心15-20min收集菌体；

（5）向步骤（4）所得菌体中加入相应体积的缓冲盐溶液，重新悬浮菌体，超声25-40min；超声结束后，冷冻离心25-40min，收集蛋白上清液；

（6）将步骤（5）所得蛋白上清液与交联直链淀粉树脂填充的层析柱结合后，用麦芽糖溶液洗脱层析柱，得到带MBP标签的TSPAN12蛋白LEL粗提品，MBP-TSPAN12 LEL；

（7）将步骤（6）所得的MBP-TSPAN12 LEL与阴离子交换柱结合后，用含有NaCl的缓冲盐溶液洗脱阴离子交换柱，收集含有MBP-TSPAN12 LEL的流出液，得到高纯度的MBP-TSPAN12LEL；

在步骤（3）和步骤（4）之间还包括步骤（8）至步骤（13）：

（8）将步骤（3）得到的含有MBP和TSPAN12蛋白LEL片段的编码序列的重组表达质粒pMal-TSPAN12 LEL，经PCR扩增出MBP和TSPAN12蛋白LEL片段的编码序列MBP-TSPAN12 LEL；

（9）将步骤（8）扩增出的MBP-TSPAN12 LEL编码序列和空白pETDuet-1质粒用限制性内切酶Nco I和Hind III酶切处理，用DNA纯化回收试剂盒回收目的片段后，用T4连接酶于2-37℃连接4~16 h；

（10）将步骤（9）的连接产物转化至大肠杆菌克隆菌株中，然后涂布于含氨苄青霉素的LB平板中，36-38℃培养12-24h，挑选单菌落测序验证MBP-TSPAN12 LEL编码序列成功连接至pETDuet-1质粒的第一个多克隆位点，得到表达带MBP标签的TSPAN12 LEL片段的重组质粒，pETDuet-1-MBP-TSPAN12 LEL；

（11）将含有二硫键异构酶C编码序列的pET40b质粒，经PCR扩增出DsbC的编码序列；

（12）将步骤（11）扩增出的DsbC的编码序列和步骤（10）得到的pETDuet-1-MBP-TSPAN12LEL质粒用限制性内切酶Nde I和Xho I酶切处理，用DNA纯化回收试剂盒回收目的片段后，用T4连接酶于2-37℃连接4~16 h；

（13）将步骤（12）的连接产物转化至大肠杆菌克隆菌株中，然后涂布于含氨苄青霉素的LB平板中，36-38℃培养12-24h，挑选单菌落测序验证DsbC编码序列成功连接至pETDuet-1质粒的第二个多克隆位点，得到能稳定表达带MBP标签的TSPAN12 LEL片段的重组表达质粒，pETDuet-1-MBP-TSPAN12 LEL-DsbC；然后将此重组表达质粒pETDuet-1-MBP-TSPAN12LEL-DsbC应用于步骤（4）中替代原步骤（3）重组表达质粒转化至表达宿主中。