[发明专利]一种水牛精原干细胞样细胞的免疫荧光染色方法

说明书

本发明公开了一种水牛精原干细胞样细胞的免疫荧光染色方法，包括以下步骤：(1)悬液制备：取水牛睾丸剪成碎块，进行两步消化后使用移液器吹成单个细胞再重悬过滤；(2)细胞纯化：将悬液接种在培养皿中培养，收集悬浮及贴壁不牢的细胞，进行两次培养后收集贴壁细胞得到纯化后的样细胞；(3)细胞固定：使用组织固定液将细胞固定，以5μl/滴的量滴在载玻片涂抹开并烘干；(4)孵育：用免疫组化笔将样本圈住，对细胞质或细胞核中的基因进行定位透膜，分别用一抗二抗孵育清洗；(5)染色：在免疫组化圈内滴加染色剂，盖上盖玻片用指甲油封片保存。本发明提供了提供一种易于操作，染色效果好的水牛精原干细胞样细胞的免疫荧光染色方法。

技术领域

本发明涉及干细胞与组织技术领域，特别涉及一种水牛精原干细胞样细胞的免疫荧光染色方法。

背景技术

精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)是形成精子的前体细胞，在雄性哺乳动物体内，精原干细胞的增殖、分化为精子的发生提供着源源不断的动力，同时也保证了遗传物质在亲子代之间的有效传递([1]Kanatsu-Shinohara et al.,2013)。自1994年成功开展精原干细胞移植技术以来([2]Brinster et al.,1994)，精原干细胞的研究成为了一个热点，且近年来又成功建立了精原干细胞的体外培养方法([3]Shinohara et al.,2003)。2011年，Shinohara等人又在体外成功开展了小鼠的无血清无饲养层的培养体系([4]Shinohara et al.,2011)，使小鼠的精原干细胞的体外培养迈上新台阶。水牛作为华南地区的特有物种，以传统役用为主，其产奶、产肉等生产性能较低，已难以满足当前人们对畜牧产品的需求。因此，若能将水牛SSCs在体外分离纯化并成功进行的体外培养，再结合移植技术和相应的遗传育种技术，将能够得到大规模的优良水牛品系。由于确定某种细胞是否为起始于干细胞十分困难，因此将这种具有水牛精原干细胞属性的细胞称为水牛精原干细胞样细胞。

水牛睾丸中有生精小管、睾丸间质、直精小管和睾丸网，要进行精原干细胞的体外培养首先要将精原干细胞分离出来，而分离效果的确认需要借助细胞染色进行观察，因此，需要寻找一个高效可行的水牛精原干细胞样细胞的免疫荧光染色方法。

发明内容

本发明的目的在于：针对上述存在的问题，提供一种易于操作，染色效果好的水牛精原干细胞样细胞的免疫荧光染色方法，且该方法操作简便可行，易于实现。

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种水牛精原干细胞样细胞的免疫荧光染色方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)悬液制备：取水牛睾丸剪成碎块，加入依次一步消化液进行一步消化，消化完成后重悬滤去上层清液，再加入二步消化液进行消化，再次重悬滤去上层清液，得到底层重悬液的精细小管内部精原干细胞释放出来，使用移液器吹成单个细胞，使用含血清的IMDM将其中和后使用移液器将细胞收集至离心管离心后，再使用培养液进行重悬后使用细胞网过滤后获得水牛睾丸单细胞悬液；

(2)细胞纯化：将步骤(1)中获得的水牛睾丸单细胞悬液接种在铺有明胶的培养皿中，使用培养液过夜培养，收集悬浮及贴壁不牢的细胞，将其转移至铺有鼠尾胶原蛋白的培养皿中，进行一次培养收集上清细胞，转移至铺有层粘连蛋白的培养皿中进行二次培养后丢弃漂浮细胞，收集贴壁细胞，得到纯化后的水牛精原干细胞样细胞；

(3)细胞固定：将步骤(2)中的到的水牛精原干细胞样细胞使用组织固定液固定，将固定好的精原干细胞样细胞以5μl/滴的量滴在洁净的载玻片上并涂抹开，置于烘箱中烘干；

(4)孵育：在步骤(3)中做好的载玻片中用免疫组化笔将样本圈住，使用TritonX-100-PBS透膜对细胞质或细胞核中的基因进行定位通透，使用马血清封闭0.5～2h后，先用一抗孵育，清洗，在进行二抗孵育和清洗，得到孵育完成的样本；