[发明专利]一种水牛睾丸单细胞悬浮液的制备方法

说明书

本发明公开了一种水牛睾丸单细胞悬浮液的制备方法，包括以下步骤：(1)原料预处理：取水牛睾丸消毒后剪去白膜，清洗干净剪成小块；(2)消化：将剪碎后的睾丸转移至培养皿中，加入一级消化液消化至呈单个精细小管后，离心弃去上清液；(3)一级重悬：用PBS重悬沉淀，离心去除上清液，重复两次后得到底层的重悬液；(4)细胞分离：进行二级消化后，放置于显微镜观察用移液器吹成单个细胞,中和后收集至离心管离心，去除上清液得到初级细胞悬浮液；(5)二级重悬：使用培养液进行重悬，使用细胞网过滤后获得水牛睾丸单细胞悬液。本发明提供了一种分离速度快，效果好的水牛精原干细胞悬浮液的制备方法，且该方法操作简便可行，易于实现。

技术领域

本发明涉及干细胞与组织技术领域，特别涉及一种水牛睾丸单细胞悬浮液的制备方法。

背景技术

精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)是形成精子的前体细胞，在雄性哺乳动物体内，精原干细胞的增殖、分化为精子的发生提供着源源不断的动力，同时也保证了遗传物质在亲子代之间的有效传递([1]Kanatsu-Shinohara et al.,2013)。自1994年成功开展精原干细胞移植技术以来([2]Brinster et al.,1994)，精原干细胞的研究成为了一个热点，且近年来又成功建立了精原干细胞的体外培养方法([3]Shinohara et al.,2003)。2011年，Shinohara等人又在体外成功开展了小鼠的无血清无饲养层的培养体系([4]Shinohara et al.,2011)，使小鼠的精原干细胞的体外培养迈上新台阶。水牛作为华南地区的特有物种，以传统役用为主，其产奶、产肉等生产性能较低，已难以满足当前人们对畜牧产品的需求。因此，若能将水牛SSCs在体外分离纯化并成功进行的体外培养，再结合移植技术和相应的遗传育种技术，将能够得到大规模的优良水牛品系。由于确定某种细胞是否为起始于干细胞十分困难，因此将这种具有水牛精原干细胞属性的细胞称为水牛精原干细胞样细胞。

水牛睾丸中有生精小管、睾丸间质、直精小管和睾丸网，要进行精原干细胞的体外培养首先要将精原干细胞样细胞分离出来，因此，需要寻找一个高效可行的分离制备精原干细胞样细胞悬液的制备方法。

发明内容

本发明的目的在于：针对上述存在的问题，提供一种分离速度快，效果好的水牛精原干细胞悬浮液的制备方法，且该方法操作简便可行，易于实现。

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种水牛睾丸单细胞悬浮液的制备方法，包括以下步骤：

(1)原料预处理：取水牛睾丸消毒后在超净台中剪去白膜，清洗干净后置于培养皿中剪成小块，再转移至EP管中剪碎；

(2)消化：将步骤(1)中剪碎后的睾丸组织转移至培养皿中，加入一级消化液置于培养箱中消化至睾丸组织基本消化呈单个精细小管后，转移至离心管离心，并弃去上清液得到下层浊液；

(3)一级重悬：步骤(2)中得到的下层浊液用PBS重悬沉淀，离心去除上清液，重复两次后得到底层的重悬液；

(4)细胞分离：将步骤(3)中的重悬液转移至培养皿中加入二级消化液消化2～5min将精细小管内部精原干细胞释放出来，放置于显微镜下观察并用移液器吹成单个细胞,使用含血清的IMDM将其中和后使用移液器将细胞收集至离心管中，离心后去除上清液得到初级细胞悬浮液；

(5)二级重悬：将步骤(4)中的初级细胞悬浮液使用培养液进行重悬后，使用细胞网过滤后获得水牛睾丸单细胞悬液。

优选的，在步骤(1)中，所述水牛睾丸为3～7个月龄水牛睾丸，所述消毒为通过75％的酒精进行浸泡消毒5～15min，所述清洗是使用含双抗的PBS重复清洗三次。