[发明专利]EvaGreen法数字PCR检测DMD拷贝数变异的引物、检测试剂盒及其检测方法

说明书

本发明公开了一种EvaGreen法数字PCR检测假肥大性肌营养不良的拷贝数变异的靶标引物和内参引物。本发明还公开了一种非诊断目的的基于EvaGreen法数字PCR的单孔同时扩增DMD基因外显子靶标和内参序列的方法。同时公开了一种检测假肥大性肌营养不良的拷贝数变异的检测试剂盒及其应用。本发明的靶标引物和内参引物的特异性好，为快速准确检测假肥大性肌营养不良的拷贝数变异提供了一种很好的方法。

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体地说，是关于一种EvaGreen法数字PCR检测DMD拷贝数变异的引物、检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

假肥大性肌营养不良(DMD)，也称Duchenne型肌营养不良症(DMD)(OMIM310200)，是最常见的一类进行性肌营养不良症。患病率为3.3/10万，占出生男婴的20-30/10万，为X-连锁隐性遗传。主要是男性发病，女性为致病基因的携带者。通常5岁左右发病。肌萎缩是进行性的，预后差，这是本病的特点。

DMD致病的主要突变形式为基因的部分缺失或重复，实现该突变形式的快速高效准确的检测，有利于此疾病的筛查、风险评估、预防以及高危女性携带者筛查。

DMD基因共有79个外显子，其中45-55号外显子，为热点的缺失重复突变区域，约占所有缺失重复变异的80％。实现快速高效的筛查该区域的拷贝数检测，可以完成绝大部分患者的筛查和其子女患病风险评估。

现有的外显子拷贝数的缺失或重复的检测方法主要有荧光原位杂交技术(Fluorescent In Situ Hybridization,FISH)、比较基因组杂交技术(array-basedcomparative genomic hybridization,aCGH)、多重连接探针扩增技术(MultiplexLigation-dependent Probe Amplification,MLPA)、定量PCR(quantitative PCR,qPCR)以及Taqman法ddPCR。然而，FISH法检测成本昂贵，对于技术人员要求过高，通量与分辨率较低；aCGH法检测成本高，检测技术太过复杂；MLPA法检测易受内参基因、不完全变性、盐浓度等参数影响，不具备普适性；qPCR法的准确性不高，易产生假阳性；Taqman法ddPCR对于探针设计成本与要求过高，PCR反应效率相比普通PCR有所降低。

因此，提供一种成本低、误差小、可行性高的外显子拷贝数的缺失或重复的检测方法具有重要的应用价值，为快速准确检测外显子拷贝数的缺失或重复提供技术手段和科学依据。

EvaGreen是分子探针公司核心研发团队独立创办的Biotium公司的明星产品。经过美国环境安全检测，及艾姆斯检测安全无毒性。它是一种同时适用于实时PCR和高分辨率溶解曲线(HRM)分析的染料。由于EvaGreen在光谱特性上类似于FAM以及SYBR Green I，因此这种染料兼容所有商业化的qPCR仪器。与SYBR Green I相比，EvaGreen对PCR的抑制性更小，更不容易产生非特异性扩增，产生的荧光信号强，安全无毒，更稳定等特点。但是，现有的EvaGreen法数字PCR检测需要正常人对照样本，受实验操作影响及孔间差异影响大，误差大。

发明内容

本发明首要目的在于提供一种EvaGreen法数字PCR检测DMD拷贝数变异的靶标引物和内参引物。本发明的第二个目的在于提供一种基于EvaGreen法数字PCR的单孔同时扩增DMD基因外显子靶标和内参序列的方法。本发明的第三个目的在于提供一种检测DMD拷贝数变异的检测试剂盒及检测试剂盒的应用。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：