[发明专利]AQP5重组过表达载体及其构建方法和用途

说明书

本发明提供一种AQP5重组过表达载体及其构建方法和用途，所述重组载体通过将目的基因AQP5插入腺相关病毒载体获得，所述腺相关病毒载体至少包括如下可操作性连接的序列元件：5’末端反相重复序列，TBG启动子序列，MCS区，P2A序列，ZsGreen基因序列，3’末端反相重复序列。经过发明人深入的研究发现AQP5重组过表达载体可以缓解小鼠心衰症状，在心衰的小鼠体内注射携带有该基因的腺相关病毒，能够有效缓解小鼠的心力衰竭的症状。小鼠各项心功能以及其他指标均得到有效改善，说明本发明的技术方案适用于心衰疾病的治疗。

技术领域

本发明涉及一种AQP5重组过表达载体及其构建方法和用途，属于生物技术领域，特别涉及治疗心血管疾病的腺相关病毒载体的构建和对治疗效果的评估。

背景技术

1、腺相关病毒

腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)是微小病毒科(Parvoviridae)家族的成员之一。这一家族成员是一类微小、无被膜及具有二十面体结构的病毒。它编码两个末端的反向重复序列(ITR)中的cap和rep基因。其中cap基因编码病毒衣壳蛋白，rep基因参与病毒的复制和整合。病毒颗粒的直径在20～26nm之间，含有大小在4.7～6kb之间的线状单链DNA基因组。从昆虫到人类都已分离到微小病毒。AAV病毒属于依赖性病毒类(Dependovirus)，最初是在纯化的腺病毒液中发现的一种污染成分，顾而得名。

AAV的生活周期有两种不同的胞内期。在无辅助病毒存在时，AAV病毒颗粒进入细胞，脱衣壳后AAV的调节蛋白发生有限的表达，并抑制病毒基因的进一步表达和病毒DNA的复制。这种负调节作用的结果是促进病毒基因组整合到宿主的基因组中建立潜伏感染。AAV生活周期的另一种胞内期是产毒性感染，往往在有辅助病毒(腺病毒或疱疹病毒)感染时发生。辅助病毒的感染可以在AAV感染之前、同时或之后进行。腺病毒(Ad)和单纯疱疹病毒(HSV)中与辅助功能有关的基因都已确定。腺病毒中参与提供辅助功能的基因包括E1a,E1b,E2a,E4和VARNA，但不包括与腺病毒DNA复制直接相关的E2b基因产物(DNA聚合酶和末端酶)。

2、AAV病毒的基因组结构和功能

人2型腺病毒伴随病毒(AAV-2)的基因组为4681个核苷酸的单链DNA，全部序列已测定。正链和负链DNA均可被包装到AAV病毒颗粒中。基因组的两末端为145bp的倒转末端重复序列(inverted terminal repeat,ITR)。ITR序列之间为AAV病毒的编码区，左侧的ORF编码4种Rep蛋白；右侧的ORF编码3种Cap蛋白。Cap基因编码衣壳蛋白，其转录从p40启动子开始，形成约2.6kb和2.3kb mRNA，拼接后分别编码三个结构蛋白VP1、VP2和VP3，分子量分别为87、73和61kDa,在成熟毒粒中的比例为1:1:10。没有VP1时，VP2和VP3就可以包装子代单链DNA。但这样的毒粒感染性较低，提示VP1在病毒颗粒的稳定性或感染性上是需要的。VP2在病毒样空颗粒的装配中起重要作用。VP3似乎需要与其它两个中的一个一起，完成核定位任务。

3、AAV的临床应用

近年来，AAV载体在临床试验上的安全性和良好治疗效果使人们对AAV载体的研究和开发充满了信心。随着AAV载体的研究和开发不断深入，其在基因治疗中存在的免疫原性、靶向性不强和转导效率不高等问题，通过改造AAV外壳蛋白，利用药物制剂、生物材料等方法也得到了一定的解决。研究表明，AAV作为颇具前景的基因治疗载体在癌症、维化、糖尿病、癫痫等众多疾病中具有良好应用前景。

4、心力衰竭

心力衰竭(心衰)又称心肌衰竭，是指心脏当时不能搏出同静脉回流及身体组织代谢所需相称的血液供应。往往由各种疾病引起心肌收缩能力减弱，从而使心脏的血液输出量减少，不足以满足机体的需要，并由此产生一系列症状和体征。心衰是一种严重影响人们健康和寿命的疾病，本领域技术人员一直致力于开发能够有效治疗或预防心衰的技术。