[发明专利]Stub1重组过表达载体及其构建方法和用途

说明书

本发明提供一种Stub 1重组过表达载体及其构建方法和用途，所PKD2重组过表达载体是将目的基因PKD2插入腺相关病毒载体获得，所述腺相关病毒载体至少包括如下可操作性连接的序列元件：EF1启动子，MCS区，CMV启动子序列，EGFP基因序列。Stub 1重组过表达载体可以高效的表达Stub 1。经过发明人深入的研究，意外地发现，Stub 1重组过表达载体可以减轻心肌缺血再灌注损伤。在经历心肌缺血再灌注小鼠体内注射携带有该基因的腺相关病毒，能够有减轻小鼠心肌缺血再灌注损伤，心肌梗塞面积明显降低，说明本发明的技术方案适用于心脏缺血再灌注的保护。

技术领域

本发明涉及一种Stub1重组过表达载体及其构建方法和用途，属于生物技术领域。

背景技术

Stub1分子是一类新型的辅助性伴侣蛋白，在蛋白质折叠、组装、转运和降解过程中起着重要的调节作用，属于泛素连接酶，Stub1具有E3泛素连接酶活性，能与Hsp70、Hsp90或者其他分子伴侣结合，促进底物的连接和链的延伸。Stub1具有调控阿尔兹海默病、帕金森、麦-考二氏综合征等神经退行性疾病相关的tau蛋白、α-突触核蛋白、MKKS突变体等降解的作用；同时Stub1还受辅助蛋白HspBP1及细胞激素Akt的调控。

腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)，是微小病毒科依赖病毒属，病毒颗粒大小约为20～26nm，完整的生活周期需要辅助病毒(通常为腺相关病毒或疱疹病毒)参与。它编码两个末端的反向重复序列(ITR)中的cap和rep基因。其中cap基因编码病毒衣壳蛋白，rep基因参与病毒的复制和整合。AAV有多种血清型，不同血清型对不同组织的亲和力不同，适用于各种体内感染实验。由于AAV的安全性能好和表达时效长的优点，目前已成为最有前景的基因治疗工具。

近十多年来缺血性心脏病的死亡率一直呈现上升趋势。心肌缺血会造成心脏受损，当心脏再灌注恢复血供的初期，会发生较缺血时更为严重的再灌注损伤。它们一起称为缺血再灌注损伤。有效减轻再灌注损伤对降低缺血性心脏病的死亡率和改善预后有着重要的意义。

本领域技术人员一直致力于开发能够有效减轻缺血再灌注损伤，从而保护心脏的技术。现有技术中的问题是缺少直接有效保护心脏抵抗缺血再灌注损伤并创伤性小的手段和方法。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种Stub 1过表达重组载体及其构建方法和用途，本发明所要解决的技术问题是提供一种可以显著改善减轻心肌缺血再灌注损伤的腺相关病毒载体。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种PKD2重组过表达载体，所PKD2重组过表达载体是将目的基因PKD2插入腺相关病毒载体获得，所述腺相关病毒载体至少包括如下可操作性连接的序列元件：

EF1启动子，MCS区，CMV启动子序列，EGFP基因序列。

腺相关病毒是一种单链无包膜DNA病毒。它通过受体介导的内吞作用进入细胞内，然后腺相关病毒基因组转移至细胞核内，保持在染色体外，不整合进入宿主细胞基因组中。

Stub 1基因在NCBI中的登录号为10273。

本发明利用天然的腺相关病毒经过基因改造后获得一种转重组过表达载体。

所述的“操作性连接”或“可操作性连接”是指两个或者多个核酸区域或核酸序列的功能性空间排列。例如，启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子的引导，从而，启动子区域可被“可操作性连接”到核酸序列上。

所述的“元件”是指一些对于蛋白的表达有用的一些列功能性核酸序列，本发明中，所述的“元件”被系统地构建以形成一种表达构建体。所述的“元件”序列是可以本发明中提供的，也包括他们的变体，只要这些元件上保留了所述“元件”的功能，其通过插入或者删除一些碱基，或者随机或定点突变等来获得。