[发明专利]一种免标记荧光检测金黄色葡萄球菌mecA基因的方法及检测试剂盒

说明书

本发明公开了一种免标记荧光检测金黄色葡萄球菌mecA基因的方法及检测试剂盒，属于分析检测领域。本发明是以发夹探针HP结合核酸外切酶Exo III辅助目标信号级联再循环扩增策略。以G‑quadruplex为信号报告分子，可现实免标记检测金黄色葡萄球菌mecA基因，简化了操作，降低了成本。整个检测过程响应迅速，简单、免标记，且灵敏度高，无需专业训练即可掌握操作流程，便于快速推广使用。本发明所述的检测方法和检测试剂盒，对环境或食品中金黄色葡萄球菌的快速检测具有重要意义。

技术领域

本发明属于分析检测领域，具体涉及一种免标记荧光检测金黄色葡萄球菌mecA基因的方法及检测试剂盒。

背景技术

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是造成人和动物感染的最主要致病菌，普遍存在于环境和食品中。即使在低浓度下，金黄色葡萄球菌也可危及人与动物的生命健康，比如会引起急性肺炎、败血症、中毒性休克等疾病。

目前，常规的金黄色葡萄球菌检测方法主要有微阵列，聚合酶链式反应，高通量测序和表面等离子共振等方法。这些方法需要对待测样品进行分离富集，操作繁琐和费时，不利于快速现场检测。近年来，利用生物传感器检测致病菌的方法备受关注，已建立荧光、电化学以及比色法等分析技术，但大多需要进行标记，因而限制了这些技术的广泛应用。

因此，迫切需要构建一种新型检测技术用于金黄色葡萄球菌的检测，使检测过程具有快速、简单、免标记和灵敏度高等特点，从而降低成本，易于推广。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，利用发夹探针(HP)和核酸外切酶(ExoIII)辅助的目标信号级联循环扩增策略，构建了一种免标记荧光检测金黄色葡萄球菌的方法及检测试剂盒。

本发明所采取的技术方案是：

一种免标记荧光检测金黄色葡萄球菌的检测试剂盒，包括发夹探针HP、缓冲溶液、N-甲基卟啉二丙酸IX(NMM)和核酸外切酶Exo III，其中发夹探针HP既包含识别原件又包含信号报告原件。发夹探针HP从5'端开始依次为I、II、III和IV区域，其中I区5'端为G-quadruplex序列；II区构成发夹探针茎环结构的环；I区中G-quadruplex序列以外的序列加上II区序列这一段区域与mecA基因序列相同，形成mecA基因类似物，而G-quadruplex序列充当信号报告因子；III区与I区完全互补，共同构成发夹探针茎环结构的茎；IV为3'端凸起，通过碱基互补识别mecA基因。本发明试剂盒中添加了Exo III，为了防止发夹探针HP被酶切，所以需要在发夹探针HP的3'端连接数个保护性碱基，使其形成3'端突出末端，即IV区。IV区序列与mecA基因的部分序列互补配对。

优选的，发夹探针HP中I区包含23-27个碱基，II区包含7-9个碱基，III区包含15-27个碱基，IV区包含9-13个碱基。

优选的，发夹探针HP的I区序列为：GGGTAGGGCGGGTTGGGATTGGGATCA(SEQ IDNO：1)。

优选的，发夹探针HP的II区序列为：TAGCGTCAT(SEQ ID NO：2)。

优选的，I与III区序列完全互补。将G-quadruplex紧紧绑住，降低背景信号。

优选的，发夹探针HP的III区序列为：TGATCCCAATCCCAACCCGCCCTACCC(SEQ IDNO：3)。

优选的，发夹探针HP的IV区序列为CTATGATCCCAAT(SEQ ID NO：4)。

优选的，发夹探针HP的序列如下所示：

HP:5'-GGGTAGGGCGGGTTGGGATTGGGATCA(I区)-TAGCGTCAT(II区)-TGATCCCA