[发明专利]一种应用Cas9技术制备CKO/KI动物模型的方法

权利要求书

1.一种应用Cas9技术制备CKO/KI动物模型的方法，所述动物模型为Nes-cre动物模型，该模型在nestin-promoter的作用下，在中枢及周围神经系统特异表达Cre酶，可作为中枢及周围神经系统特异性诱导LoxP重组的Cre工具鼠，其特征在于，是将体外表达纯化的Cas9蛋白、预先用胚胎进行sgRNA切割效率测试筛选出的针对待改造基因位点的高效率sgRNA、以及根据模型需求制备的单链DNA打靶载体，三者混合后进行动物胚胎注射及移植；将移植后出生的F0代小鼠进行基因型鉴定，鉴定正确的F0进行配繁以获得F1代小鼠，对F1代小鼠进行鉴定分析验证，得到CKO/KI动物模型，具体包含以下步骤：

步骤一：准备具有核酸酶活性的Cas9蛋白用于后续步骤，所述Cas9蛋白是在体外表达纯化制备得到；

步骤二：筛选sgRNA，适用于合成的RNA

(1)设计针对待改造基因位点的sgRNA并制备转录模板

(2)采用转录试剂盒，体外转录sgRNA，转录好的sgRNA备用

(3)将步骤(2)的sgRNA与步骤一的Cas9蛋白，通过显微注射或电转的方式转入小鼠受精卵中，对得到的胚胎进行sgRNA切割活性检测；筛选出切割活性最佳的sgRNA，备用；其中，用于Nes-Cre动物模型制备所使用的sgRNA为SEQ ID NO：4所示的Nes-Cre-S2；

步骤三：打靶载体方案设计、构建

根据需求制定模型制作方案，并依此为基础进行打靶载体方案的设计，根据打靶载体方案进行载体构建，以单链DNA作为打靶载体；用于Nes-Cre动物模型制备所使用的打靶载体序列如SEQ ID NO.11所示，其是包含敲入位点同源臂、Nestin promoter、Cre CDS、HGHpolyA原件的打靶载体；

步骤四：胚胎注射及移植

将步骤三正确构建的打靶载体与步骤一的Cas9蛋白以及步骤二得到的切割活性最佳的sgRNA混合，用混好的样品进行胚胎注射及移植；

步骤五：移植后生出的小鼠标记为F0，将F0进行基因型鉴定，对已经性成熟且基因型鉴定正确的F0进行配繁，其后代小鼠标记为F1，对F1小鼠进行分析验证，基因型验证正确的F1小鼠即为制备的CKO/KI动物模型。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤二的(1)具体是：通过设计网站设计针对改造位点的sgRNA，构建sgRNA转录载体，制备体外转录模板。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤二的(3)中所述对得到的胚胎进行sgRNA切割活性检测，确认sgRNA切割活性。