[发明专利]大籽猕猴桃EST-SSR分子标记及其应用

说明书

本发明公开了一种大籽猕猴桃EST‑SSR分子标记及其应用，大籽猕猴桃EST‑SSR分子标记是3个具有多态性的EST‑SSR分子标记AM‑es03、AM‑es06和AM‑es09，其序列如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.6所示。本发明以8个大籽猕猴桃群体及3个同属亲缘关系较近猕猴桃属植物基因组DNA模板为研究对象，根据转录组序列信息，选择其中以三碱基为重复基元的SSR位点，采用Primer 5.0设计EST‑SSR引物。经过PCR扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳、克隆验证、STR基因分型筛选出3个具有多态性的EST‑SSR分子标记，能够有效、快速地鉴别猫人参药材的基源植物大籽猕猴桃与其近源种。这些分子标记可用于大籽猕猴桃的种质鉴定及评价，以及研究种群的遗传多样性。

技术领域

本发明涉及分子标记与药用植物鉴定技术领域，尤其涉及一种大籽猕猴桃EST-SSR分子标记及其应用。

背景技术

分子标记在种质资源多样性研究中有着广泛的应用。DNA水平的多态性主要表现核苷酸序列的差异，对于任何类型的核苷酸序列的差异都可用分子标记技术对其进行检测。其中简单重复序列(Simple Sequence Repeat，SSR)又称微卫星序列，是由1～6个核苷酸的串联重复单元组成的一类DNA序列。SSR标记呈现出以下优点：(1)广泛存在于真核生物的基因组中、多态性丰富；(2)其产物进行测序凝胶电泳分离时单碱基分辨率高、共显性标记遗传信息量大；(3)呈孟德尔式遗传，具有很好的稳定性，DNA用量少，技术要求低，成本低廉，PCR扩增的可重复性高。因此，SSR标记是目前最具应用价值的分子标记之一，已经被广泛应用于基因的快速定位、指纹图谱和遗传图谱的构建以及分子标记辅助选育及种质鉴定等研究。然而，SSR标记物种特异性一定程度上限制了其引物的通用性，有限的基因序列资源依然是SSR标记开发的瓶颈。

2005年以来，第二代高通量测序技术的发展为规模化遗传变异检测和标记位点开发带来了新机遇。SSR可从表达序列标签(Express sequence tag，EST)库或转录组测序数据中挖掘，称之为EST-SSR。与基因组SSR相比，EST-SSR开发相对较易，但其多态性相对较低。筛选高多态性的EST-SSR分子标记对于遗传研究与种质资源评价均具有重要的价值。目前，基于转录组信息进行SSR标记引物开发在忍冬(Lonicera japonica)、丹参(Salviamiltiorrhiza)、红豆杉(Taxus cuspidata)、三七(Panax notoginseng)、紫苏(Perillafrutescens)和杜仲(Eucommia ulmoides)等药用植物上得到有效应用。

中国是猕猴桃属植物的起源、进化及分布中心，其遗传资源极为丰富，占全世界猕猴桃遗传资源种属总数的96％。由于猕猴桃属植物现行分类的主要依据是少数一些表观性状，而形态性状本身易受环境的影响；加之该属物种间自然杂交和种质渗入频繁，且染色体倍性复杂，致使对一些种的界定模糊，系统位置难于确定。其中，大籽猕猴桃(Actinidiamacrosperma)特产于我国，主产于浙江、江西、安徽等地，为华东地区常用大宗药材“猫人参”的基源植物(俗称“红货”)，收载于《中药大辞典》等中药典籍，具有清热解毒、消肿疖等功效，临床用于治疗骨髓炎、肺癌深部脓肿、消化系统肿瘤和肝硬化黄疸腹水等，连续数年位居抗肿瘤配方中的前十名。市场调查结果显示，大籽猕猴桃药材资源的巨大消耗，市场上正宗“红货”几乎告罄，除临床用量需加倍的“白货”对萼猕猴桃(A.valvata)外，黑蕊猕猴桃(A.melanandra)、中华猕猴桃(A.chinensis)、小叶猕猴桃(A.lanceolata)、毛花猕猴桃(A.eriantha)等同属近缘种、甚至其它不同科植物被纷纷混充作猫人参流入市场，成为其在生产和临床上面临的较突出问题。