[发明专利]一种快速鉴别东方无线鳎和黑颊无线鳎的分子生物学方法

说明书

本发明涉及分子生物技术领域，解决了通过测序的方法对物种鉴定存在操作繁琐、耗费时间较长的问题，公开了一种快速鉴别东方无线鳎和黑颊无线鳎的分子生物学方法。该方法先分别提取东方无线鳎和黑颊无线鳎的基因组DNA，然后设计扩增ITS区域的通用引物，使用通用引物分别对东方无线鳎和黑颊无线鳎的基因组DNA进行核糖体内转录ITS区扩增反应，得到两者扩增产物，最后分别对两者扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，比较扩增产物长度，条带长的为黑颊无线鳎，条带短的为东方无线鳎。本发明直接通过比较序列长度进行物种鉴别，从而免去了测序过程，既节约了成本，大大提高了工作效率。

技术领域

本发明涉及分子生物技术领域，尤其是涉及一种快速鉴别东方无线鳎和黑颊无线鳎的分子生物学方法。

背景技术

东方无线鳎和黑颊无线鳎同属鲽形目舌鳎科无线鳎亚科无线鳎属，形态上非常相近，主要通过背、臀鳍有无黑色横纹，鳃孔高与头高比例进行区分。但是由于其离水后颜色很容易就褪去，且鳞片也很容易脱落，加上通过测量计算，要求十分精密，过程十分繁琐，导致两者很难通过形态特征进行鉴定，因而导致种类鉴定及系统进化上的混乱。中国专利公开号CN104531688公开了一种蜘蛛线粒体基因组全序列扩增引物及扩增方法，该发明采用的提取蜘蛛基因组的总DNA通过线粒体基因组DNA的长PCR扩增和测序对蜘蛛进行鉴定，但其仅能对蜘蛛进行扩增；此生物品种鉴定必须通过测序才能对物种进行准确判断，操作繁琐，鉴定耗费时间较长，鉴定效率低下。

发明内容

本发明是为了克服现有技术通过测序的方法对物种鉴定存在操作繁琐、耗费时间较长的问题，提供一种能够快速鉴定东方无线鳎和黑颊无线鳎的分子生物学方法，该方法操作简单，成本较低。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种快速鉴别东方无线鳎和黑颊无线鳎的分子生物学方法，包括以下步骤：

1)分别提取东方无线鳎和黑颊无线鳎的基因组DNA；

2)从Genbank数据库中获取鲽形目舌鳎科鱼类18SrDNA和28SrDNA序列，利用ClustalXv1.83做序列的比对，分别在3’端和5’端找出保守序列用于设计扩增ITS区域的通用引物；

3)使用通用引物分别对东方无线鳎和黑颊无线鳎的基因组DNA进行核糖体内转录ITS区扩增反应，得到两者扩增产物；

4)分别对两者扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，比较扩增产物长度，条带长的为黑颊无线鳎，条带短的为东方无线鳎。

核糖体ITS区域(ITS1-5.8S-ITS2)是一段位于核糖体RNA编码基因18S rDNA和28SrDNA中间的一段基因，包括两段非编码区(ITS1和ITS2)和一段编码区(5.8S rDNA)，其进化速率相对较快，在种内基本趋于相似，而在种间则表现出显著的差异，且不同种类的ITS长度差异非常明显，因此可以在两端的18S rDNA和28S rDNA上设计引物，用于扩增两种无线鳎的ITS1-5.8S-ITS2rDNA序列，直接通过凝胶电泳肉眼比较两种无线鳎的ITS1-5.8S-ITS2rDNA序列长度异质性进行种类鉴别，从而免去了测序过程，既省去了繁琐复杂的形态鉴定程序，又节约了成本，更重要的是大大提高了工作效率。

作为优选，所述步骤1)中提取东方无线鳎和黑颊无线鳎的基因组DNA方法为标准酚-氯仿法。

作为优选，所述步骤2)中通用引物的正向引物序列为TCGCTACTACCGATTGGATGGTTTA，反向引物序列为GCTCTTCCCTCTTCACTCG。

作为优选，所述步骤3)中扩增反应体系为：取100ng模板DNA，0.5μL浓度为10μmol/L的正向引物，浓度为0.5μL浓度为10μmol/L的反向引物，2.5μL 10×buffer，1.5μL浓度为25mmol/L的MgCl₂，0.5μL浓度为10mmol/L的dNTP，0.2μL Taq聚合酶混合，加双蒸水至25μL。