[发明专利]一种表达ALV-K囊膜蛋白的重组病毒的构建方法

说明书

本发明公开了一种构建表达ALV‑K囊膜蛋白的重组病毒方法，具体为：设计PCR扩增ALV‑J传染性克隆线性化表达载体引物以及PCR扩增ALV‑K‑env基因引物序列；PCR扩增ALV‑K囊膜蛋白基因片段和ALV‑J传染性克隆线性化载体，构建重组传染性克隆质粒，并将重组质粒转染DF‑1细胞拯救出表达ALV‑K囊膜蛋白的重组病毒。本发明利用ALV‑J传染性克隆，构建了高效复制及表达ALV‑K囊膜蛋白的重组病毒。这一重组病毒的获得不仅为研究ALV‑K囊膜蛋白功能受体及其致病性打下了基础，更能够为临床检测ALV‑K的中和抗体提供靶向病毒。

技术领域

本发明涉及一种构建表达ALV-K囊膜蛋白的重组病毒的方法。此发明不仅为研究ALV-K 囊膜蛋白功能受体及其致病性打下了基础，而且为临床检测ALV-K中和抗体提供了靶向病毒。因此，本发明具有一定应用价值。

背景技术

禽白血病病毒(Avian leukosis virus,ALV)是可引起禽类患多种肿瘤及免疫抑制性疾病的反转录病毒。根据其囊膜蛋白特征，该病毒可分为A-K共11个亚群。其中A，B，J亚群较为常见，且J亚群目前在国内最为常见。ALV-J感染主要造成鸡造血细胞恶性增生，引起髓细胞瘤、血管瘤及严重的免疫抑制，对国内外养禽业造成巨大经济损失。随着国内ALV净化工作的推进，鸡群ALV-J的感染及其发病率显著下降。ALV-K是近年来在国内地方品种鸡中分离鉴定出的新型禽白血病病毒。由于ALV-K病毒复制能力较弱，病毒蛋白表达水平较低，目前ALV通用检测试剂盒对其检测效果不是很好，且尚无商品化特异性ALV-K抗原及抗体检测试剂盒。

发明内容

本发明的目的是在于提供一种构建表达ALV-K囊膜蛋白的重组病毒方法。本发明的原理和最核心的关键技术是科学合理的设计引物，PCR扩增ALV-K囊膜蛋白基因片段和ALV-J 传染性克隆线性化载体，构建重组传染性克隆质粒，并将重组质粒转染DF-1细胞拯救出表达 ALV-K囊膜蛋白的重组病毒。本发明利用ALV-J传染性克隆，构建了高效复制及表达ALV-K 囊膜蛋白的重组病毒。这一重组病毒的获得不仅为研究ALV-K囊膜蛋白功能受体及其致病性打下了基础，更能够为临床检测ALV-K的中和抗体提供靶向病毒。

本发明公开了PCR扩增ALV-J传染性克隆线性化表达载体引物以及PCR扩增ALV-K-env 基因引物序列。本发明还公开了一种基于重组酶ExnaseTM II将线性化的ALV-J传染性克隆表达载体与ALV-K-env基因片段PCR产物不经酶切连接反应，直接重组克隆的技术；并通过转染DF-1细胞获得表达ALV-K囊膜蛋白的重组病毒，具体方案为：

(1)K亚群禽白血病病毒基因组的制备：首先将K亚群禽白血病病毒感染细胞后的上清经细胞裂解液裂解，随后用酚、氯仿、异戊醇进行病毒基因组抽提，最后用无水乙醇沉淀，溶于30uL灭菌超纯水，即得ALV-K前病毒DNA，置-20℃备用；

(2)PCR扩增ALV-K env基因片段和ALV-J传染性克隆线性化载体：首先设计出扩增ALV-K env基因的引物以及ALV-J传染性克隆线性化载体的引物；然后以ALV-J传染性克隆质粒以及ALV-K前病毒DNA为模板，利用相应引物分别PCR扩增出ALV-K-env和线性化的ALV-J 线性化载体。

(3)ALV-K-env-J重组表达载体的构建：利用重组酶ExnaseTMⅡ将线性化的ALV-J载体以及ALV-K env基因的PCR产物进行快速体外重组克隆，重组克隆经序列验证后，命名为 ALV-K-env-J传染性克隆质粒，并挑取阳性细菌菌液进行质粒制备。

(4)将ALV-K-env-J传染性克隆质粒转染DF-1细胞，六天后将部分上清继续在DF-1细胞上盲传3代。PCR检测盲传三代后提取的细胞基因组，以IFA及PCR方法检测盲传3代后的细胞上清，结果证明ALV-K-env-J传染性克隆病毒拯救成功。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：