[发明专利]一种检测血浆游离DNA中肺癌相关突变基因的试剂盒及其应用

说明书

本发明涉及一种检测血浆游离DNA中肺癌相关突变基因的试剂盒及其应用。本发明公开了血浆游离DNA中肺癌相关LRP1B、KMT2D、CSMD3突变基因及突变位点，以及检测上述血浆游离DNA中LRP1B、KMT2D、CSMD3突变基因的试剂盒，该试剂盒包括根据上述LRP1B、KMT2D、CSMD3突变基因设计的特异性引物及特异性探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～68所示，以及缓冲液，dNTPs，TaqDNA聚合酶，MgCl₂和DNA提取试剂盒。本发明首次揭示了LRP1B、KMT2D、CSMD3基因突变在非小细胞肺癌诊断中的应用，并能很好的鉴别肿瘤良恶性。

技术领域

本发明涉及一种检测血浆游离DNA中肺癌相关突变基因的试剂盒及其应用，属于生物技术和医学领域。

背景技术

肺癌是目前世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，严重影响人们的身体健康。有研究数据统计显示，目前到医院就诊和接受治疗的肺癌患者中，80％以上到医院就诊时已为中晚期肺癌，早期肺癌(I期)仅占19.10％。早期肺癌通过手术等综合治疗，患者的5年生存率在90％以上，10年生存率接近70％。而中、晚期肺癌患者的5年生存率分别为30％和10％左右。因此，提高肺癌治愈率的有效方法就是：早期发现、早期诊断和早期治疗。

影像学检查是肺癌诊断的初步手段，胸部CT分辨率更高，目前已应用于健康查体，能发现很小的肺部病灶。从肺部病变的影像学表现，如分叶、毛刺、胸膜皱缩征等，可以初步判断肺部阴影是恶性或良性肿瘤。但有时肺部病灶在胸部CT的表现不典型，从CT表现看很难区分病灶的良恶性。而血液肿瘤标志物检测，如CEA、NSE、CYF-211的敏感性和特异性低，亦不能确诊良恶性。这些因素给肺癌的诊断带来困难。

目前肺癌确诊的主要手段仍是病理学诊断。取得病理的方法包括纤维支气管镜、经皮肺穿刺活检等。纤维支气管镜检查，在气管内可发现中心型肺癌在气管内的形态，并可取得病理，但检查有痛苦，存在获取组织量少、假阴性的可能。一些位于肺周边的病变，纤维支气管镜亦无法探查到。另一种常用的经皮肺穿刺活检，是一种有创性操作，有出血、感染、气胸等风险，且穿刺组织量较少，亦有假阴性的可能性，甚至有肿瘤细胞通过针道转移的风险。这两种方法有取得病理的可能，但亦有风险。

理想的诊断方法应为操作简单、创伤较小、样本获取容易、阳性率高。血浆游离DNA(cellfreeDNA，cfDNA)是细胞通过细胞凋亡、坏死等途径释放至外周血中的DNA片段。健康人的cfDNA主要来自骨髓细胞、淋巴细胞以及正常的组织细胞。对于患肿瘤的病人，肿瘤细胞同样会通过该途径将肿瘤细胞的DNA片段释放至外周血，这种DNA片段称为循环肿瘤DNA(circulatingtumorDNA，ctDNA)，大小约150-200bp。血浆游离的ctDNA中包含了肿瘤的遗传信息，对于疾病的诊断、治疗和监测预后有重要意义。高通量测序是目前研究ctDNA的高效手段，但检测花费较高，检测发现的突变基因是否与肺癌相关，亦难以确定。

实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质检测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。在PCR反应体系中加入引物和特异性荧光探针，将报告荧光基团和淬灭荧光基团标记在寡核苷酸探针两端。探针完整不被破坏时，5’端的报告基团发射的荧光信号会被3’端的淬灭基团吸收。而在PCR反应扩增时，Taq DNA聚合酶将与模板结合的探针酶切降解，使探针的淬灭基团与报告基团分离，发出荧光信号，实现荧光信号积累和PCR产物形成的同步。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明公开了血浆游离DNA中肺癌相关突变基因及突变位点，其中肺癌相关突变基因包括LRP1B、KMT2D、CSMD3突变基因，提供了一种检测血浆游离DNA中肺癌相关LRP1B、KMT2D、CSMD3突变基因的试剂盒，该试剂盒能够快速、便捷、准确的检测血浆游离DNA中LRP1B、KMT2D、CSMD3基因的突变情况。