[发明专利]一种测定吸烟者尿液中尼古丁和可替宁的方法

说明书

本发明提供了一种测定吸烟者尿液中尼古丁和可替宁的方法，包括如下步骤：(1)标准工作曲线的建立：配制标准工作液和内标工作液，并以实际尿液样品为基质进行混合标准溶液的配制，利用UPLC‑MS/MS分析并建立标准工作曲线；(2)收集尿液样品，并进行前处理，利用甲醇和水调节尿液的稳定性；(3)将步骤(2)调节后的尿液样品过滤，利用UPLC‑MS/MS对尿液样品进行检测，根据步骤(1)建立的标准曲线计算吸烟者尿液样品中尼古丁和可替宁含量。本发明采用甲醇替代硫酸氢钠来调节尿液的稳定性，避免加入硫酸氢钠所造成的基质效应，大大提高了质谱检测器灵敏度。

技术领域

本发明属于烟草烟气暴露生物标记物检测领域，具体涉及一种测定吸烟者尿液中尼古丁和可替宁的方法。

背景技术

吸烟与健康是当今世界最受关注的公共卫生问题之一，而科学测量烟草暴露是研究烟草暴露与健康相关性的基础。尼古丁及其代谢物可替宁是评价烟草暴露的关键生物标记物，可通过尿液、血液、唾液和头发等生物材料中的尼古丁和可替宁的测定评估人体烟草暴露的剂量和程度。尿液样本采集方便，对受试者侵害性小，是供吸烟与健康研究最理想的生物样品。因此建立准确、快速的吸烟者尿液中尼古丁和可替宁检测方法对吸烟与健康研究具有重要指导意义。

目前国内外对尼古丁和可替宁的测定方法进行过大量研究，方法主要有：酶联免疫法(ELISA)、气相色谱法(GC-MS)、高效液相色谱法(HPLC)和液相色谱-质谱法(LC-MS/MS)。其中，ELISA法受到基体干扰以及实验操作影响较大，而GCMS由于要从水相的尿液中进行分离提取目标物，前处理操作较为复杂，因此，HPLC法和HPLC-MS/MS法是最常用的方法，而和传统的HPLC法相比，HPLC-MS/MS法具有更高的灵敏度和选择性，但是由于尿液样品内含有多种蛋白质和酶，为了进行即时的烟草暴露信息监测，必须对样品进行预处理。据报道，尿液样品中尼古丁相对稳定，半衰期较长，但可替宁由于半衰期较短，在尿液中活性酶的作用下会继续分解，1天内变化率就达30％，存在含量不稳定的结果。文献中采用硫酸氢钠作为稳定剂，但由于采用LC-MS/MS检测，加入硫酸氢钠时会造成基质效应，会使质谱检测器灵敏度大大下降并影响分析结果。

因此寻找一种有效、方便的尿液稳定方法，并通过UPLC-MS/MS进行吸烟者尿液中的尼古丁和可替宁含量的测定十分迫切且必要。

发明内容

本发明提供一种测定吸烟者尿液中尼古丁和可替宁的方法，其有效解决了现有的尿液中尼古丁和可替宁的测试方法前处理操作复杂繁琐、尿液不稳定、耗时长的问题。

一种测定吸烟者尿液中尼古丁和可替宁的方法，包括如下步骤：

(1)标准工作曲线的建立：配制标准工作液和内标工作液，并以实际尿液样品为基质进行混合标准溶液的配制，利用UPLC-MS/MS分析并建立标准工作曲线；

(2)收集尿液样品，并进行前处理，利用甲醇和水调节尿液的稳定性；

(3)将步骤(2)调节后的尿液样品过滤，利用UPLC-MS/MS对尿液样品进行检测，根据步骤(1)建立的标准曲线计算吸烟者尿液样品中尼古丁和可替宁含量。

上述测定吸烟者尿液中尼古丁和可替宁的方法，步骤(1)包括如下具体步骤：

a、标准工作液的配制：准确称取尼古丁和可替宁标准品各0.1g于100mL的2个容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得到1.0mg/mL的混合标准溶液；使用时用甲醇稀释成0.01mg/mL的标准工作液；

b、内标工作液的配制：准确称取d⁴-尼古丁和d³-可替宁标准品各0.05g于100mL的2个容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得到5.0mg/mL的内标工作液；