[发明专利]一种利用LC-MS/MS检测食品中甲壳动物原肌球蛋白的方法有效

专利信息
申请号: 201811219583.1 申请日: 2018-10-19
公开(公告)号: CN109061013B 公开(公告)日: 2021-06-22
发明(设计)人: 王建华;葛敏敏 申请(专利权)人: 青岛海关技术中心
主分类号: G01N30/02 分类号: G01N30/02
代理公司: 青岛海昊知识产权事务所有限公司 37201 代理人: 张中南;邱岳
地址: 266000 山东省*** 国省代码: 山东;37
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摘要:
搜索关键词: 一种 利用 lc ms 检测 食品 甲壳动物 肌球蛋白 方法
【说明书】:

一种利用LC‑MS/MS检测食品中甲壳类原肌球蛋白的方法,从36种甲壳动物中获得原肌球蛋白氨基酸序列,进行序列对比得到其高度保守区域,模拟酶解过程得到一系列肽段,选择不含半胱氨酸和蛋氨酸的肽段,进行高分辨质谱检测,选择响应高、重复性好的肽段作为原肌球蛋白的定量肽段,制备高纯度标准品,以定量肽段标准品的浓度值为横坐标,以其定量子离子峰面积作为纵坐标绘制标准曲线,待测样品经酶解净化后待LCMS/MS检测,进而计算得到样品中原肌球蛋白浓度。本发明从具有代表性且性质稳定的特征肽段中选择酶解较稳定且酶解效率高的作为定量肽段,消除蛋白结构变化、蛋白修饰及基质效应等对检测的影响,具有准确、精密和灵敏等优点。

技术领域

本发明属于食品过敏原的检测方法,具体涉及一种液相色谱串联质谱检测甲壳动物主要过敏原原肌球蛋白的方法。

背景技术

全球范围内,甲壳动物的致敏率为0.2%,研究表明,甲壳动物的主要过敏原是原肌球蛋白(tropomyosin,TM),由两个相同的亚基组成一种肌原纤维蛋白,分子量为35-38kDa。原肌球蛋白是一种稳定性较强的蛋白质,对热、研磨及常规加工方法不敏感。

目前国内外对甲壳动物中原肌球蛋白的检测方法有不少报道,主要有酶联免疫法(ELISA)、聚合酶链式反应法(PCR)及液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)。其中传统的过敏原检测方法ELISA和PCR最为常用,但是ELISA方法容易受食品中基质的干扰而出现假阴性假阳性的结果;PCR方法通过检测编码过敏原蛋白基因是否存在从而说明过敏原存在的可能,这种方法可以实现对过敏原蛋白基因的定量,但是对过敏原蛋白的定量存在较高的不确定性。

LC-MS/MS的过敏原检测方法通过检测酶解得到的特征肽段来对目标过敏原蛋白进行定性定量分析。色谱的分离有效地降低基质干扰,选择多个特征肽段防止出现假阳性和假阴性结果。LC-MS/MS的甲壳动物原肌球蛋白的定量方法的建立最重要的是特征肽段的选择和定量肽段的选择。目前为止,国内外利用 LC-MS/MS方法检测食品中甲壳动物原肌球蛋白的研究主要集中在对原肌球蛋白的定性方面,定量方面的研究很少。

发明内容

为了解决现有技术中的问题,本发明提出一种利用LC-MS/MS(液相色谱串联质谱)检测甲壳动物原肌球蛋白的方法,包括如下步骤:

步骤(1)从UniProt蛋白库搜索到甲壳动物原肌球蛋白氨基酸序列;该原肌球蛋白氨基酸序列长度为284,涵盖了19种虾、3种虾蛄、2种虾鳌、3种龙虾和10种蟹在内的37种甲壳动物;

步骤(2)将该氨基酸序列导入DNAMAN软件,进行氨基酸序列对比,得到其高度保守区域80-215,同源性高达98.52%;

步骤(3)将原肌球蛋白高度保守区域导入Skyline软件,模拟酶解过程,模拟酶解结束后得到一系列肽段;

步骤(4)选择不含有半胱氨酸(C)和蛋氨酸(M)、且长度在8-18个氨基酸之间的肽段,得到此类肽段92IQLLEEDLER101113LAEASQAADESER125153FLAEEADR160190IVELEEELR198206SLEVSEEK213共五个;

步骤(5)将上述五个肽段进行高分辨质谱检测,选择响应高、重复性好的IQLLEEDLER、LAEASQAADESER和IVELEEELR三个肽段作为甲壳类动物原肌球蛋白的特征肽段;

步骤(6)将特征肽段进行化学合成,制备纯度高于95%的标准品;

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