[发明专利]QX型IBV血凝抑制试验抗原及其制备方法与应用

说明书

本发明涉及QX型IBV血凝抑制试验抗原及其制备方法与应用。HI抗原的制备方法如下：将10⁴～10⁷EID₅₀QX型IBV病毒株接种鸡胚，37℃孵育进行病毒增殖，36～48h取出鸡胚，2～8℃冷却6～16h，收集鸡胚尿囊液，经浓缩后与I型磷酸酯酶C混匀，37℃摇床作用2～2.5h后，于2～8℃放置21～35d即得。本发明提供的HI抗原和检测方法具有高特异性、高稳定性、高灵敏度、高效率的特点，可在2h内对临床血清样本进行快速检测，本发明可广泛应用于IB的检疫、诊断、免疫后抗体的检测，使HI方法检测QX型传染性支气管炎变得可行，为防治IB的发生提供实用的、科学的手段，以更好地指导养禽生产中对该病的防控。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及QX型IBV血凝抑制试验抗原制备方法与应用。

背景技术

禽传染性支气管炎(Infectious Bronchitis，简称IB)是由传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus，简称IBV)引起的一种急性、高度接触性的呼吸系统和泌尿生殖系统疾病，典型临诊特征为病鸡呼吸困难，气管啰音等呼吸道症状，QX型毒株会导致肾脏肿大苍白，呈“花斑肾”，进而引起鸡只死亡，雏鸡阶段感染该病还会对母鸡生殖系统造成永久性伤害。

目前，大量公开报道表明，QX型(肾病变型)已代替Mass型成为国内IBV主要流行毒株类型，给养禽业带来了很大危害，所以QX型IB进行快速准确的监测和诊断对于控制疫情及调整免疫程序至关重要。国际上已经建立很多血清学诊断方法，其中间接血凝试验、病毒中和试验、间接荧光抗体技术等方法由于试验条件要求较高，应用受到了限制；琼脂扩散试验(AGP)、酶联免疫吸附试验(ELISA)等由于各自的局限性，导致重复性差，成本高，检测效果不理想，并不适合在基层实验室推广。

IBV抗体的HI试验检测是一种快速、敏感、特异、简便、实用的血清学检测方法。虽然目前国内外已成功制备了鸡传染性支气管炎病毒(M41株)血凝抑制试验抗原，但由于该毒株属于Mass型，与目前国内主要流行毒株(QX型)进化关系较远，导致生产实践检测中常表现假阴性，从而M41株血凝抑制试验抗原应用于临床检测中准确率大大下降。因此在养殖场中无法进行QX型IBV的检测，一旦发生疫情，就会造成巨大的损失且容易造成病毒的快速传播，从而引起更大的危害。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的缺陷，为保证较高的IBV检出率和检测结果的准确性，针对目前国内主要流行毒株QX型IBV，研发出QX型IBV血凝抑制试验抗原，可广泛用于鸡传染性支气管炎疫苗的免疫检测及现场诊断。

为了实现本发明目的，本发明提供一种制备QX型IBV血凝抑制试验抗原方法，按照10⁴-10⁷EID₅₀的量(优选10⁵EID₃₅)将QX型IBV病毒株接种9～11日龄鸡胚(SPF鸡胚，每胚0.1～0.2mL)，于37℃孵育进行病毒增殖，弃去24h内的死亡鸡胚，孵育36～48h后取出鸡胚，于2～8℃冷却6～16h，收集鸡胚尿囊液；鸡胚尿囊液经浓缩后与I型磷酸酯酶C(PLC1)混匀，I型磷酸酯酶C的终浓度为2.5U/mL，37℃摇床作用2～2.5h后，于2～8℃放置21～35d，即得抗原。收集的病毒尿囊液可直接进行浓缩或保存于-80℃冰箱中备用。

前述的方法，鸡胚尿囊液的浓缩方法如下：无菌法收集鸡胚尿囊液，将鸡胚尿囊液8000rpm离心45～60min，取上清液；然后40000rpm离心2h，弃上清，沉淀用第一次离心后所得上清液体积1/200的生理盐水悬浮。

鸡胚尿囊液经浓缩后与I型磷酸酯酶C混匀，I型磷酸酯酶C的终浓度为2.5U/mL，37℃摇床(优选200r/min)作用2～2.5h后，于2～8℃(优选4℃)放置21～35天。