[发明专利]一种具有诊疗功能外泌体及其制备方法

说明书

本发明公开了一种具有诊疗功能外泌体及其制备方法，属于纳米医学技术领域。该方法包括：1)外泌体提取、纯化：从C57小鼠充间质干细胞培养液中提取该细胞分泌的外泌体，得到的外泌体重悬于10mM PBS溶液中，‑80℃保存备用；2)制样：将制备好的姜黄素或吲哚菁绿溶液与步骤1)的外泌体混合于10mM PBS中，得到样品；3)电转：将步骤2)的样品进行电穿孔，得到电穿孔后的样品；4)孵育：将步骤3)电穿孔的样品置于细胞培养箱中避光孵育30min，得到孵育后的液体；5)纯化：将步骤4)中孵育后的液体离心60‑100min，取沉淀物，得到具有诊疗功能外泌体。本发明操作简易，重复率高。

技术领域

本发明属于纳米医学技术领域，特别涉及一种具有诊疗功能外泌体及其制备方法。

背景技术

化疗仍然是肿瘤治疗的主要方式之一。但大部分化疗药物存在水溶性差、代谢快、生物相容性差、体内分布不理想和细胞渗透能力低等缺陷，严重限制了化疗药物的效果和利用率。因此，构建一种新型的药物载体，以提高药物溶解度和稳定性，提高组织穿透性，提高肿瘤部位药物浓度，同时避免被免疫细胞所捕获是当前研究热点。

外泌体在药物运输上的独特优势，使其成为研究热点之一。外泌体是由哺乳动物细胞衍生的纳米囊泡，直径大概在40-200nm左右。外泌体能够被宿主识别为“自身”，因此其作为一种活性载体，可以将某些细胞RNA、药物分子等物质递送至哺乳动物细胞中。这种囊泡状小体作为载体具有独特的优势，如其免疫原性低，在血液中的稳定性高，向细胞运输药物的效率高和更强的增强渗透滞留效应等。目前，已有研究者利用外泌体负载药物，结果表明与游离药物相比较，外泌体负载药物具有更好的抗肿瘤活性。但外泌体负载药物效率较低，专利CN108114290A公开了一种同时负载化学药物和纳米材料的外泌体的制备方法，用电转方法将姜黄素与纳米四氧化三铁装载到外泌体中，但全文对于外泌体包封率没有表述。外泌体能够用于多种不同类型药物的负载，包括核酸分子(mRNA，siRNA等)、化学药物(姜黄素、吲哚菁绿等)和纳米材料(纳米银、纳米铁等)。

姜黄素是从姜科姜黄属植物姜黄根茎中提取的一种脂溶性酚类物质，其结构中含有酚羟基，在细胞膜发生脂质过氧化反应时，其酚羟基可以发生氧化反应，能有效终止自由基反应，因而其表现出诸多生理活性，比如抗氧化、抗肿瘤、防止衰老等诸多功效。体外实验表明，姜黄素能够显著抑制肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭，并促进肿瘤细胞凋亡。因此，姜黄素在多种癌症中具有广阔的应用前景。吲哚菁绿(ICG)是当前唯一一种被美国FDA认证的近红外(NIR)染料。研究表明，ICG具有光动力学性质，能够被强穿透力的NIR光激发后能产生活性氧。进而能够通过光热治疗和氧化自由基联合作用于肿瘤部位，达到杀死肿瘤细胞的效果。因此，ICG是目前被认为光热治疗中最具有前景的药物。

传统的肿瘤治疗只能通过药物抑制肿瘤生长，而对于肿瘤内部的诊断和病情评价不够及时、准确。我们通过探讨不同电转参数和药物质量比例，提供了一种高效制备具有诊疗一体化功能的外泌体方法，将药物快速高效包载到外泌体内部，同时能够用于多种药物组合包载，实现肿瘤治疗和诊断的协同性和一致性。

发明内容

本发明的首要目的在于克服目前存在的技术缺陷，提供一种具有诊疗功能外泌体的制备方法。该方法操作简便、重复率高。制得的外泌体具有较高的包封率和诊疗一体化功能，能够适用于多种单一药物的包载及多种组合药物的共载。该方法制备得到的外泌体具有化疗、光热治疗、光动力学治疗及成像等功能，为肿瘤等多种疾病的诊断和治疗提供了一种新的载体及其制备方法。

本发明的另一目的在于提供由上述制备方法得到的具有诊疗功能外泌体。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种具有诊疗功能外泌体的制备方法，包括如下步骤：

1)外泌体提取、纯化：采用差速超速离心法从C57小鼠充间质干细胞培养液中提取该细胞分泌的外泌体，得到的外泌体重悬于10mM PBS溶液中，-80℃保存备用；