[发明专利]细胞凋亡检测试剂盒及其检测方法和应用

说明书

本发明公开了一种细胞凋亡检测试剂盒及其检测方法和应用，该试剂盒，包括共价结合了荧光素FITC的Annexin V，还包括荧光染料DAPI。所述DAPI的浓度＜150nM。本发明还涉及采用所述的试剂盒检测细胞凋亡的方法，以荧光素FITC共价结合的Annexin V特异性结合磷脂酰丝氨酸来识别凋亡细胞，联合DAPI标记死细胞和凋亡晚期细胞；最后利用流式细胞仪或者荧光显微镜检测细胞凋亡的发生并区分凋亡早、晚期的细胞和死细胞。使用Annexin V‑FITC组合DAPI的双染法能够有效避免具有红色到橙色荧光基团的药物对细胞凋亡检测的干扰。

技术领域

本发明涉及生物医药领域，特别是指一种基于AnnexinV-FITC和DAPI双标记的细胞凋亡检测试剂盒及其检测方法和应用。

背景技术

细胞凋亡存在于多细胞生物的整个生命过程当中，可及时清除机体内多余和受损伤的细胞，维持组织器官的稳定性，在维持组织、器官的正常形态和功能方面起重要作用。目前采用的细胞凋亡检测方法包括：利用光学显微镜的细胞形态学检测法、DNA片段化分析法、原位末端缺口标记法(TUNEL)和Annexin V-FITC/PI双染法等。其中Annexin V-FITC/PI双染法由于灵敏度和特异性高，并且操作简便易行，评价指标客观而成为目前应用最为广泛的细胞凋亡检测方法。

其实验原理是：正常细胞中，磷酯酰丝氨酸(PS)位于细胞脂质双层膜的内侧；只有当细胞凋亡发生时，磷酯酰丝氨酸会翻转到细胞膜外侧。Annexin V能在Ca²⁺存在情况下特异性识别与结合细胞膜外侧的磷酯酰丝氨酸，通过使用共价结合了荧光素FITC的AnnexinV即可标记凋亡细胞。此外，由于正常细胞和早期凋亡细胞的细胞膜相对完整而凋亡晚期及坏死细胞的细胞膜通透性显著增加，使得核酸染料碘化丙啶(propidine iodide,PI)能够选择性进入凋亡中晚期及坏死细胞而标记。由此，通过荧光素FITC(Fluoresceinisothiocyante，异硫氰酸荧光素酯)共价结合的Annexin V特异性识别细胞膜外表面的PS，联合PI检测凋亡晚期和坏死细胞，即可使用流式细胞仪检测细胞凋亡的发生，同时区分凋亡早、晚期的细胞及坏死细胞并确定其比例。

然而，在当前肿瘤细胞凋亡研究中，多种细胞凋亡诱导药物如蒽环类药物盐酸多柔比星和光敏剂如玫瑰红(Rose bengal)等，具有与PI相同的激发光(535nm)和发射光波长(617nm，橙色到红色范围)，从而导致上述药物处理后的细胞在使用Annexin V-FITC/PI双染法进行细胞凋亡检测时无法区分坏死细胞与正常、凋亡细胞。

鉴于上述原因，目前仍需提供新的简便易行、具有高灵敏度和特异性的方法用于细胞凋亡的检测。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种细胞凋亡检测试剂盒及其检测方法和应用，该试剂盒可以可检测细胞凋亡的发生并区分凋亡早、晚期的细胞和死细胞，同时有效避免具有红色到橙色荧光基团的药物对细胞凋亡检测的干扰。

本发明所采用的技术方案是，一种细胞凋亡检测试剂盒，包括共价结合了荧光素FITC的Annexin V，还包括荧光染料DAPI。

进一步地，所述DAPI的浓度＜150nM。

本发明还涉及采用所述的试剂盒检测细胞凋亡的方法，以荧光素FITC共价结合的Annexin V特异性结合磷脂酰丝氨酸来识别凋亡细胞，联合DAPI标记死细胞和凋亡晚期细胞；最后利用流式细胞仪或者荧光显微镜检测细胞凋亡的发生并区分凋亡早、晚期的细胞和死细胞。

本发明还涉及所述试剂盒在检测细胞凋亡中的用途。

本发明还涉及所述试剂盒在检测细胞凋亡中的用途，检测过程中使用具有红色到橙色荧光的药物诱导细胞凋亡。