[发明专利]一种获得高保真且3’末端加“A”产物的PCR法

说明书

本发明公开了一种获得高保真且3’末端加“A”产物的PCR法，该方法为：首先在PCR反应体系中加入各反应组分与高保真Taq DNA polymerase，然后按如下反应程序进行PCR扩增：(1)95℃预变性2min；(2)95℃，15sec；退火温度，30sec；72℃，延伸时间；28循环；(3)在反应的PCR管中直接加入普通Taq DNA聚合酶并混匀；(4)95℃，15sec；退火温度，30sec；72℃，延伸时间；3循环；(5)72℃，10min。本发明在利用高保真Taq DNA polymerase进行PCR反应的最后3个循环中加入普通Taq DNA polymerase，PCR完成后即可获得具有高保真性的3'末端加“A”的PCR产物，克服了当前高保真PCR过程中无法在产物3'末端直接加“A”的问题，省略了以前需要对高保真PCR产物纯化后再用加“A”的过程，简化了高保真PCR产物TA克隆前的处理步骤。

技术领域

本发明涉及一种获得高保真且3’末端加“A”产物的PCR法，属于PCR法技术领域。

背景技术

PCR技术是分子生物学领域最经典也是最常用的一种实验方法，主要用于基因检测和克隆，由于其过程简单、实验周期短、重复性好、且试剂成本相对较低，使其成为分子生物学领域中最受欢迎的方法之一。在基因获取上，虽然目前有许多方法可供选择，如化学合成，但PCR技术具有不可替代的优势，且仍是最重要的方法。

PCR技术用于基因克隆的基本过程是首先获取靶基因的DNA模板或cDNA模板，然后设计并合成靶基因的上游引物和下游引物，选用适当的Taq DNA polymerase和PCR程序经高效扩增获得PCR产物，即靶基因DNA，产物经纯化和适当处理后克隆入克隆载体，并经过细菌转化、筛选和鉴定获得靶基因。

PCR产物导入克隆载体中因产物的不同而有所差异，这与PCR过程中选择的TaqDNA polymerase密切相关。如果选用普通的Taq DNA polymerase，其PCR产物的3'末端有一个自带的突出的“A”，它可以与市面上的TA克隆载体直接通过T-A配对连接而高效获得带有靶基因的克隆载体。但是，由于普通Taq DNA polymerase自身特性，其PCR产物常伴有一定的碱基突变，不能真实克隆靶基因，为克服这一缺陷，目前分子生物学上常用具有保真性的Taq DNA polymerase替代常规的Taq DNA polymerase，如pfu DNA polymerase、platinumTaq DNA polymerase、High-Fidelity DNA polymerase等，但无论是哪一种高保真Taq DNApolymerase，其PCR产物末端为平末端，不存在3'突出“A”，为保证该PCR产物能够克隆入克隆载体中，目前生物试剂公司推出了平末端克隆载体，但克隆效率低这一缺陷限制了这种平末端载体的推广和运用。考虑到这一问题，生物试剂公司还推出对PCR平末端产物加“A”的A-tailing酶，通过对纯化的PCR平末端产物的3'末端加“A”，实现T-A克隆，这一方法效率较高，受到广大科研工作者的欢迎，但其过程需要对PCR产物进行电泳鉴定、纯化、加“A”等步骤才能进行TA克隆。

综上所述，用普通Taq DNA polymerase扩增的目的DNA片段虽然3'末端有突出的“A”，但其内部常含有突变位点；用高保真Taq DNA polymerase扩增的PCR产物其3'末端为平末端，不能直接进行TA克隆，需要对PCR产物用特殊的加“A”试剂盒在3'末端加“A”后才能进行TA克隆；而将普通Taq DNA聚合酶和高保真Taq DNA聚合酶直接混合使用(如某生物公司的Taq Platinum DNA Polymerase)虽然部分解决了上述问题，但PCR产物的高保真性和产物3'末端加“A”效率均明显下降。

因此，探索一种可以获得高保真PCR产物且3'末端加“A”的简单、快速的方法具有较高的应用价值。

发明内容