[发明专利]基于电位分辨电化学发光的抗原检测方法

说明书

本发明公开了一种基于电位分辨电化学发光的抗原检测方法，包括：制备电化学发光探针；将电化学发光探针掺杂到聚合物微球；将检测抗体标记到聚合物微球表面，得到检测抗体和电化学发光探针双重编码聚合物微球；将捕获抗体共价标记到磁微球表面，得到捕获抗体标记的免疫磁微球；将双重编码聚合物微球和免疫磁微球放入待测溶液中，磁分离，再通过溶胀聚合物微球释放电化学探针；采集电化学探针在不同电位下的电化学发光信号，识别检测的抗原。本发明提供的抗原检测方法改善了单组分电化学发光免疫分析检测时间长、通量低等缺点，实现了多种肿瘤标志物的快速、高通量、高灵敏联合检测，非常适合针对目标肿瘤开发试剂盒，用于肿瘤早期大规模筛查。

技术领域

本发明属于肿瘤标志物同时识别与检测领域，尤其涉及基于电位分辨电化学发光的抗原检测方法。

背景技术

常规影像学检查在肿瘤早期诊断中捉襟见肘，而组织活检技术对患者侵害性较大，不适于预后判断和疗效监测。肿瘤标志物是肿瘤细胞通过基因表达而合成、分泌，或由机体对肿瘤发生反应而生成的一类物质，在肿瘤早期筛查、预后判断及疗效监测等方面有重要作用。因此，需要发展高灵敏度的免疫传感器用于肿瘤标志物的检测。目前已报道的免疫传感器大多用于单一肿瘤标志物检测。然而，肿瘤标志物并不具备器官特异性，单一肿瘤标志物对于肿瘤细胞异常表现的敏感性或特异性偏低。如癌胚抗原(CEA)在肺癌、乳腺癌、结直肠癌、宫颈癌等多种癌症中均可检出。寻找针对某一种肿瘤，并具有100％特异性和敏感性的“理想”肿瘤标志物是十分困难的。临床上为了提高肿瘤检测的准确性和可靠性，往往都是检测与目标肿瘤相关的一组标志物，因此，亟待发展多组分免疫分析新方法与新技术。

迄今为止，科研人员已结合免疫分析、核酸杂交等生化分析手段，将多种光电分析方法，如荧光分光光度法、化学发光法、电化学发光法、电化学法和光致电化学法等用于肿瘤标志物的检测。其中，电化学发光无需外加光源，设备简单，采用其作为输出信号的传感器灵敏度高、背景信号低。目前已构建的多指标电化学发光免疫分析传感器大多采用空间分辨的形式实现不同肿瘤标志物的区分的。这种结构的传感器需要构建光电性能稳定的多孔板电极阵列，分析成本高，样品消耗量大。发明专利“一种检测双肿瘤光致电化学免疫传感器的构建方面”(专利申请号：201711054579.X)公开了一种基于枝状二氧化钛纳米棒-钛酸锶(B-TiO₂NRs-SrTiO₃)异质结双组份光致电化学免疫传感器的构建方法，可实现甲胎蛋白和糖类抗原153的同时检测。该方法由于激发光源和检测信号完全分离，在检测过程中背景信号被极大地削弱，从而提高了检测灵敏度。但是，水热法合成纳米材料易受环境影响，重复性较差，进而影响到修饰电极界面的稳定性和重现性。

最近发展起来的电位分辨多色电化学发光免疫分析法，受到人们广泛的关注。实现电位分辨电化学发光的发光体种类繁多，既可以是分子发光体，也可以是纳米发光体，抑或是二者形成的杂化体。目前，使用最为广泛的电化学发光分子是三联吡啶钌(II)(Ru(bpy)₃²⁺)及其衍生物，这类化合物发光强度稳定，发光效率高，但其发光波长单一，已报道的钌联吡啶配合物的电化学发光波长大多位于红橙光范围；而且钌(II)金属配合物的中心金属配位场分裂能有限，采用配体修饰等策略对其发光波长调控的能力极其微弱，因此，限制了其在多指标同时检测中的应用。金属铱(III)的配位场分裂能高于钌(II)，可用于短波长电化学发光探针分子的制备。理论上，可以从激发和发射两个途径区分电化学发光过程。合成一系列发射波长迥异的发光分子，即可通过调节发射过程实现电化学发光的光谱分辨，该过程的调制相对简单。但是，对于电化学发光激发过程的调制则比较复杂，其难点在于发光体的选择和激发电位的控制上。对于大多数发光体，一旦施加的电位达到发光电位临界值，发光会持续产生。如果多种发光体的发射波长相近，则很难通过测试发光强度实现精确的多组分定量分析，除非发光体具备电位分辨能力。

发明内容

本发明的目的在于提供一种提出了一种基于电位分辨多色电化学发光对同一样本中多种抗原同时检测的方法，该方法灵敏度高、检测通量高、分析速度快、样品消耗量少。