[发明专利]紫杉醇的生产方法

权利要求书

1.一种紫杉醇的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)选用红豆杉的嫩茎上的芽体作为培养材料，经洗洁精和自来水洗净，置流水下冲洗10-30分钟后，置于75％酒精中处理10-30秒，然后再经0.1％的升汞消毒后用无菌水冲洗，切去外植体变色的部分，然后进行诱导培养，选取连续继代3～5次且生长旺盛、质地疏松、状态稳定均一的新鲜胚性愈伤组织接种到液体悬浮培养基中，震荡培养，每7-8天继代一次，经2-3个月的继代培养建立稳定生长的红豆杉形成层干细胞培养体系；

2)往悬浮培养的培养基中添加红豆杉内生真菌提取液，混合均匀，获得混合培养液，将混合培养液置于生物反应器中，选取生长速率达9.0～12.0mg/g·d的红豆杉形成层干细胞培养体系，按接种率不小于10％的接种量接种到生物反应器中进行悬浮培养，培养温度为24℃-26℃，人工光照条件下进行通气培养6-8天，向液体悬浮培养基中加入茉莉酸甲酯和忧遁草提取物继续培养以诱导红豆杉形成层细胞累积产生紫杉醇；

3)收集经步骤2)悬浮培养的培养物，使用磷酸缓冲溶液进行洗涤3-5次，离心，获得沉淀物，往所述沉淀物中添加去离子水，超声波破碎5-10min，离心获得上清液，往所述上清液中添加乙酸乙酯，静置，待分层后收集水相，水相重复用乙酸乙酯萃取2-3次，收集水相，添加乙醇溶液低温减压浓缩得浸膏I；

4)将所述浸膏I用适量无水乙醇溶解后，形成粗提液，加入与无水乙醇相同体积的丙酮，静置沉降10-11h，过滤，在滤液中添加活性炭颗粒，置于43-46℃的条件下进行脱色处理，过滤，往滤液中添加大孔树脂吸附，然后用不同浓度的乙醇进行梯度洗脱，合并洗脱液后低温减压浓缩得浸膏II；

5)往所述浸膏II添加四氢呋喃-丙酮混合液加热溶解，冷切至室温，自然结晶，晶体再次溶解到四氢呋喃-丙酮混合液进行重结晶2-3次，获得高纯度的紫杉醇。

2.根据权利要求1所述的紫杉醇的生产方法，其特征在于，在培养皿内设置发芽床，所述发芽床从上到下第一层为滤纸第二层为海绵，所述海绵的高度为2-4毫米，将所述培养皿高压蒸汽灭菌，冷切后添加液体诱导培养基，在所述滤纸层上添加消毒后的培养材料，控制培养条件，进行诱导培养，获得愈伤组织。

3.根据权利要求2所述的紫杉醇的生产方法，其特征在于，所述培养条件为：温度23-25℃，采用蓝光LED灯和红光LED灯进行交替照射，蓝光LED灯照射3-5小时，光照强度为1500-1800lux；红光LED灯照射1-2小时，光照强度为2200-2500Lux。

4.根据权利要求2所述的紫杉醇的生产方法，其特征在于，所述诱导培养基为在每升MS培养基中添加α-萘乙酸0.8-1.2mg，苄氨基腺嘌呤0.5-0.7mg，赤霉素0.2-0.3mg和槲皮素0.6-0.8mg。

5.根据权利要求1所述的紫杉醇的生产方法，其特征在于，所述红豆杉内生真菌提取液的制备方法为：将红豆杉内生真菌接种到PDA液体发酵培养基中，在温度为27-29℃，转速为80-100r/min的摇床中振挡培养4-6天，培养结束后超声波破碎5-8min，添加与培养基等体积的乙酸乙酯进行活性成分萃取，待溶液分层后去掉水层，获得萃取液，减压干燥所述萃取液，添加0.2-0.4倍萃取液体积的去离子水，获得所述红豆杉内生真菌提取液。

6.根据权利要求5所述的紫杉醇的生产方法，其特征在于，往所述萃取液添加等体积的水，待溶液分层后去掉水层，进行重复萃取2-3遍。

7.根据权利要求1所述的紫杉醇的生产方法，其特征在于，所述红豆杉内生真菌提取液添加量为悬浮培养的培养基质量的5-10％。

8.根据权利要求1所述的紫杉醇的生产方法，其特征在于，所述忧遁草提取物的制备方法为：将忧遁草原料烘干粉碎过100-200目筛，获得筛下粉末，往筛下粉末中添加无水乙醇，在4-8℃的条件下保存24-28h，过滤，获得滤液，减压蒸馏所述滤液获得获得乙醇提物粗浸膏，往所述乙醇提物粗浸膏中添加去离子水溶解，然后添加正丁醇萃取，将正丁醇萃取液减压浓缩得浸膏，再次添加去离子水溶解，获得忧遁草提取物。