[发明专利]高纯度紫杉醇的制备方法

说明书

本发明提供一种高纯度紫杉醇的制备方法，包括以下步骤：1)建立稳定的红豆杉形成层干细胞培养体系；2)往悬浮培养的培养基中添加红豆杉内生真菌提取液，接种红豆杉细胞，人工光照条件下进行通气培养6‑8天，向液体悬浮培养基中加入茉莉酸甲酯和忧遁草提取物继续培养；3)收集红豆杉细胞，进行紫杉醇的粗提取；4)对粗提取物进行纯化；5)将上述浓缩液II通过C18高效液相色谱纯化柱，然后用甲醇进行洗脱，收集并合并紫杉醇洗脱部分，减压蒸发溶剂甲醇以使紫杉醇结晶释出，离心收集晶体，将晶体进行真空冷冻干燥，获得高纯度紫杉醇浓缩液II。本发明具有诱导成功率高、紫杉醇提取纯度高等特点。

技术领域

本发明涉及药用植物的细胞培养技术领域。更具体地说，本发明涉及一种高纯度紫杉醇的制备方法。

背景技术

红豆杉是红豆杉科(Taxaceae)红豆杉属(Taxus)的一类乔木和灌木，全世界共11种。红豆杉具有较广的分布范围，从欧亚大陆和北美的亚北极区到中美和东南亚的亚热带甚至热带地区均有分布。研究表明，红豆杉中的紫杉醇对治疗卵巢癌、肺癌、结肠癌、转移性乳腺癌、黑色素瘤、白血病等多种癌症有特效，致使紫杉醇成为当前最热门的抗癌药物之一。然而，现有技术中，紫杉醇来源与从红豆杉的树皮中获取，含量非常低，提取困难，提取纯度低，根本无法满足人们对对高纯度紫杉醇日益增长的需求。因此，提高紫杉醇的纯度具有重要意义。。

发明内容

作为各种广泛且细致的研究和实验的结果，本发明的发明人已经发现，在红豆杉细胞悬浮培养阶段添加红豆杉内生真菌提取液能提高单位细胞中紫杉醇的含量。基于这种发现，完成了本发明。

本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种高纯度紫杉醇的制备方法，其能够提高单位细胞中紫杉醇的含量，防止红豆杉细胞在培养过程中发生变异。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种高纯度紫杉醇的制备方法，其包括以下步骤：

1)选用红豆杉的嫩茎上的芽体作为培养材料，经洗洁精和自来水洗净，置流水下冲洗10-30分钟后，置于75％酒精中处理10-30秒，然后再经0.1％的升汞消毒后用无菌水冲洗，切去外植体变色的部分，然后进行诱导培养，选取连续继代3～5次且生长旺盛、质地疏松、状态稳定均一的新鲜胚性愈伤组织接种到液体悬浮培养基中，震荡培养，每7-8天继代一次，经2-3个月的继代培养建立稳定生长的红豆杉形成层干细胞培养体系；

2)往悬浮培养的培养基中添加红豆杉内生真菌提取液，混合均匀，获得混合培养液，将混合培养液置于生物反应器中，选取生长速率达9.0～12.0mg/g·d的红豆杉形成层干细胞培养体系，按接种量不小于10％的接种量接种到生物反应器中进行悬浮培养，培养温度为24℃-26℃，人工光照条件下进行通气培养6-8天，向液体悬浮培养基中加入茉莉酸甲酯和忧遁草提取物继续培养以诱导红豆杉形成层细胞累积产生紫杉醇；

3)收集经步骤2)悬浮培养的培养物，使用磷酸缓冲溶液进行洗涤3-5次后进行冷冻干燥，得到冻干粉，往所述冻干粉末中添加去离子水，水浴加热浸泡所述冻干粉，离心过滤，滤渣加水反复浸泡2-3次，合并滤液，用乙酸乙酯进行搅拌萃取，静置，待分层后收集水相，水相重复用乙酸乙酯萃取2-3次，收集水相，添加乙醇溶液低温减压浓缩得浸膏I；

4)将所述浸膏I用适量无水乙醇溶解后，形成粗提液，加入与无水乙醇相同体积的丙酮，静置沉降10-11h，过滤，在滤液中添加活性炭颗粒，置于43-46℃的条件下进行脱色处理，过滤，往滤液中添加大孔树脂吸附，然后用不同浓度的乙醇进行梯度洗脱，合并洗脱液后低温减压浓缩得浓缩液II；

5)将上述浓缩液II通过C18高效液相色谱纯化柱，然后用甲醇进行洗脱，收集并合并紫杉醇洗脱部分，减压蒸发溶剂甲醇以使紫杉醇结晶释出，离心收集晶体，将晶体进行真空冷冻干燥，获得高纯度紫杉醇浓缩液II。