[发明专利]一种基于共进化网络的ω-转氨酶突变体以及制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种基于共进化网络的ω‑转氨酶突变体以及制备方法和应用。该ω‑转氨酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3所示。本发明获得的ω‑转氨酶突变体的半失活温度为42.2℃和43.8℃，比野生型酶提高3.7℃和5.3℃，在40℃下的半衰期为20.6min和26.0min，比野生型酶延长13.7min和19.1min。本发明利用蛋白质共进化网络指导ω‑转氨酶的研究，将生物信息学与计算机软件相结合，预测影响ω‑转氨酶结构和功能作用的重要位点，构建突变文库，以获得酶活及热稳定进一步改善的突变体，有效增加突变成功率，提高筛选工作量，提高实验效率。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种基于共进化网络的ω-转氨酶突变体以及制备方法和应用。

背景技术

转氨酶是5’-磷酸吡哆醛(pyridoxal-5'-phosphate,PLP)依赖性酶，广泛存在自然界中，能催化氨基由氨基供体向氨基受体的转移反应，在细胞的氮代谢过程中发挥着重要作用。转氨酶作为生物催化剂可用于催化制备手性胺类化合物，作为合成治疗糖尿病药物、心血管药物、神经类药物、抗高血压药物和抗感染药物的重要中间体。

根据PFAM数据库中的多序列比对，转氨酶可以被分为5类：天冬氨酸转氨酶、芳香族转氨酶、ω-转氨酶、支链转氨酶和D-转氨酶。由于ω-转氨酶(ω-transaminase，简称ω-AT)的底物结合口袋大于天冬氨酸转氨酶、芳香族转氨酶，并可以催化一些特定的底物，因此具有更好的工业应用价值。另外转氨酶还具有较高区域选择性和立体选择性等优点。转氨酶既可以通过动力学拆分消旋胺，也能通过酮的不对称合成生成手性胺，比传统化学催化方法更具有吸引力和竞争力。

来自土曲霉(Aspergillus terreus)的ω-AT能催化(R)-(+)-α-甲基苄胺与酮酸反应生成苯乙酮，手性选择性为(R)型。ω-转氨酶的催化过程如下所示：

目前，关于分子改造ω-转氨酶提高其热稳定性的研究已有报道。例如：

授权公告号为CN105441404B的发明专利文献公开了ω-转氨酶突变体及其编码基因和制备方法，该发明利用温度因子结合能量优化策略对野生型ω-转氨酶进行突变位点预测，进而进行定点突变，筛选得到的突变体的半失活温度高达40.9℃，比野生型酶提高2.9℃。

申请公布号为CN105950581A的发明专利申请文献公开了一种引入二硫键的ω-转氨酶突变体及其应用，该发明根据ω-转氨酶的三维结构模型，分析蛋白质结构中B-factor数据，结合键长、键角、能量等生物信息学特征，使用生物信息学计算软件Disulfide byDesign对该酶进行引入二硫键的理性设计，选出二硫键潜在的引入位点；然后结合相应位点B-factor值，选择该蛋白的不稳定区域引入二硫键，设计定点突变引物，以ω-转氨酶基因为模板，进行定点突变，PCR扩增、纯化后，筛选得到含有一个半胱氨酸的突变体，再以该突变体为模板，进行定点突变得到同时含有两个半胱氨酸的突变体，转化至宿主细胞，获得定点突变文库；最后从所述定点突变文库中筛选效果较好的ω-转氨酶突变体。该方法ω-转氨酶突变体由土曲霉(Aspergillus terreus)ω-转氨酶131位的精氨酸和134位的天冬氨酸分别突变为半胱氨酸获得，该ω-转氨酶突变体的半失活温度比野生型提高了1.6℃；在40℃下的半衰期为10.4min，比野生型延长了3.5min，较野生型提高了50.7％，热稳定性大大提高。

申请公布号为CN107058256A的发明专利申请文献公开了ω-转氨酶突变体及其制备方法和应用，该发明依据在自然进化过程中，同源蛋白质的氨基酸序列某些特定位置向蛋白质结构和功能有利的方面趋于一致的机制，利用生物信息学技术筛选出与待改造生物酶同源的序列，并进行序列一致性分析，确定待改造生物酶中与同源序列不一致的氨基酸残基位点作为突变对象，进而利用定点突变技术进行改造。