[发明专利]检测莲草直胸跳甲OR基因转录水平的引物及方法

权利要求书

1.一种检测莲草直胸跳甲OR基因转录水平的荧光定量PCR引物，其特征在于：包括符合荧光定量PCR反应特点的上下游引物：

OR-F：5`-ATCCTTACTCAATTCTGGACTTCC-3`，

OR-R：5`-TGCTTATCTCATGCTGGACAA-3`。

2.一种采用权利要求1所述引物检测莲草直胸跳甲OR基因转录水平的荧光定量PCR方法，其特征在于：按如下步骤：

（1）cDNA第一链合成：提取样本的总RNA并纯化，采用反转录试剂盒得到以提取的RNA为模板反转录得到的cDNA；

（2）对下述引物进行常规PCR检测

该基因的荧光定量上下游引物：

OR-F：5`-ATCCTTACTCAATTCTGGACTTCC-3`；

OR-R：5`-TGCTTATCTCATGCTGGACAA-3`；

以及作为内参基因的上下游引物：

Tubulin-F: 5`-AGATGTCCGCCACCTTCA-3`；

Tubulin-R: 5`-GCCTCTTGGTATTGTTGGTATTCA-3`；

常规PCR扩增体系为25µL：10×buffer 2.5µL ，dNTP 1.0µL，上游引物0.5µL，下游引物0.5µL，100ng/µL cDNA模板1.0µL，Ex-TaqE 0.15µL，水19.35µL；

常规PCR反应程序为：94℃预变性5 min，然后94℃变性30 s， 56℃退火30 s， 72℃延伸1 min，此条件下35个循环，最后72℃再延伸10min；

（3）实时荧光定量PCR反应：

以步骤（1）得到的cDNA为模板，加入步骤（2）所述的引物，进行荧光定量PCR反应，每个样品设置3个重复，扩增后取平均值；

实时荧光定量PCR扩增体系为：SYBR^® Premix Ex Taq^TM12.5µL，上游引物0.5µL，下游引物0.5µL，100ng/µL cDNA 1.0µL，补足水至25µL；

实时荧光定量PCR反应程序为：95℃预变性 30 s，然后95℃变性5 s 、60℃退火30 s，40个循环。