[发明专利]一种用于快速鉴别半滑舌鳎和长吻红舌鳎的引物及其设计方法和应用方法

权利要求书

1.一种用于快速鉴别半滑舌鳎和长吻红舌鳎的引物，其特征在于，所述用于快速鉴别半滑舌鳎和长吻红舌鳎的引物中正向引物为SEQ ID NO.1：5’-TCGCTACTACCGATTGGATGGTTTA-3’，反向引物为SEQ ID NO.2：5’-GCTCTTCCCTCTTCACTCG-3’。

2.一种如权利要求1所述的用于快速鉴别半滑舌鳎和长吻红舌鳎的引物的设计方法，其特征在于，所述方法为：Genbank数据库中下载半滑舌鳎和长吻红舌鳎的rDNA序列，对这些序列进行多重比对，分别在3’端和5’端找出比较保守的序列以及变异较大的区域，并在两端保守的18S rDNA和28S rDNA上设计引物，扩增出两种形态非常接近的舌鳎鱼类ITS1-5.8S-ITS2序列。

3.一种如权利要求1所述引物的应用方法，其特征在于，所述引物可用于对半滑舌鳎和长吻红舌鳎的鉴定。

4.根据权利要求3所述的一种应用方法，其特征在于，所述鉴定包括以下步骤：

1)DNA抽提试剂盒法提取待测半滑舌鳎和长吻红舌鳎的rDNA；

2)采用权利要求1中所述的引物，并以待测半滑舌鳎和长吻红舌鳎的rDNA作为模板，进行PCR扩增，得到扩增产物；

3)对扩增产物进行凝胶电泳，试剂盒法割胶回收扩增片段，对回收得到的扩增片段进行观察和鉴定。

5.根据权利要求4所述的一种应用方法，其特征在于，步骤1)所述提取rDNA时为避免肠道内容物污染，舍去其头颈部，仅从其尾部提取rDNA。

6.根据权利要求4所述的一种应用方法，其特征在于，步骤2)所述PCR扩增的反应体系组成为：2.5mM的dNTP2μL、10×TaqDNA聚合酶Buffer2.5μL、10μM的正向引物SEQ IDNO.1和反向引物SEQ ID NO.2各1μL、5U/μL的TaqDNA聚合酶0.2μL、100g/μL的rDNA模板溶液1μL及灭菌双蒸水17.3μL；

所述PCR扩增条件为：95℃预变性5min，随后95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸60s，共进行35个循环，最后进行72℃延伸5min，4℃条件下保存。

7.根据权利要求4所述的一种应用方法，其特征在于，步骤3)所述凝胶电泳采用1.0％琼脂糖凝胶进行。

8.根据权利要求4所述的一种应用方法，其特征在于，步骤3)所述的观察可通过直接肉眼观察进行，并比较所回收的扩增片段长度进行快速鉴定。