[发明专利]一种高效的小鼠骨髓来源巨噬细胞的转染方法及其应用

说明书

本发明为一种高效的小鼠骨髓来源巨噬细胞的转染方法及其应用，其包括以下步骤：1)首先将293T细胞传代至60mm*15mm皿中，培养过夜，使其密度达到80％，按照目的质粒/psPAX2/pMD2.G的顺序以6/3/1的比例进行慢病毒的包装，以获得高滴度慢病毒，滴度为2～3×10⁷TU/mL(总体积5mL)；2)取小鼠骨髓，加入鼠源M‑CSF(10ng/mL)进行巨噬细胞诱导，在诱导的第二天加入慢病毒，可以获得高转染效率。本发明在巨噬细胞诱导过程中加入慢病毒，不但能够提高了慢病毒的转染效率，同时还能在不影响巨噬细胞得率的情况下，缩短实验时间。

技术领域：

本发明涉及生物技术领域，具体为一种高效的小鼠骨髓来源巨噬细胞的转染方法及其应用。

背景技术：

转染是分子生物学和细胞生物学领域的重要实验技术，是将外来遗传物质转移到真核细胞中的专门技术。随着基因和蛋白质功能研究的深入，转染已成为现代分子生物学研究中常见的基本方法，将外源遗传物质引入细胞为细胞水平的基因功能研究奠定了基础。随着近年来基因工程技术的不断发展，出现了多种多样的转染技术，按外源遗传物质是否与基因组整合来分，转染技术为稳定转染和瞬时转染两大类；按转染实施手段来分，转染技术分为物理介导、化学介导和生物介导三大类。

物理介导的方法中比较常用的是电穿孔法，但细胞敏感性较高，且对细胞活力影响较大。目前实验室最常用的是化学介导方法，以脂质体转染法最为普遍，商品化脂质体转染试剂易于使用和购买，对于293T等容易转染的细胞，转染效率较高且毒性较低，但对于原代细胞及其他难转细胞，脂质体技术的转染效率较低，无法满足实验要求，限制了该方法的使用。生物介导的方法常用的是慢病毒转染技术和腺病毒转染技术，适用于较难转细胞如原代细胞，但制备过程较为复杂，且影响转染效率因素较多。针对不同模型，使用不同的转染方法，转染技术的不同影响着转染效率，从而影响到整个实验结果。因此在进行细胞转染前，需对转染方法及需转染的细胞等因素进行综合分析，筛选出转染的最适方法和条件，已达到最高转染效率，满足实验要求。

慢病毒载体是以人类免疫缺陷I型病毒(HIV-1)为基础发展起来的病毒载体，包含了病毒包装、基因转染、稳定整合基因组所需要的遗传信息，是慢病毒系统的主要组成部分。慢病毒载体可以感染处于有丝分裂活跃期的细胞，也可以感染分裂缓慢及处于分裂终末期的细胞，包括神经干细胞、造血干细胞、肝实质细胞和处于分化终末的神经元等。在体外培养细胞实验和体内基因治疗实验中，由慢病毒载体携带需转入的目的基因以得到可以长期而稳定的表达。此外，经过改建后的慢病毒载体不表达任何HIV-1蛋白，免疫原性低，可以容纳约10kb左右的外源基因，因此大多数基因的cDNA都能被克隆入慢病毒载体。这些优点使慢病毒载体成为体内和体外基因转染的一种有效工具。

巨噬细胞是单核-吞噬细胞系统中的重要成员，分布在身体的各个器官、组织中。巨噬细胞具有广泛的功能，包括吞噬、抗原递呈、防御微生物的细胞毒性作用，以及分泌生长因子、细胞因子、补体成分、溶菌酶、蛋白酶、凝血因子和前列腺素等，对机体的免疫功能、炎症反应、组织重塑和疾病产生等具有重要作用。巨噬细胞可以被多种刺激信号激活，如病原体相关分子模式(PAMPs)和损伤相关分子模式(DAMPs)，以及组织微环境中的细胞因子等，在天然免疫和获得性免疫中都发挥着重要作用。巨噬细胞还调控着炎症的起始和消退，在抗感染方面起到了“哨兵”的角色。同时巨噬细胞也可以促进机体正常发育，维持体内平衡状态，在特定的病理条件下也对疾病的形成起到关键作用，如自身免疫病、自身炎症性疾病、代谢性疾病以及肿瘤等。

体外将骨髓细胞诱导成巨噬细胞是研究巨噬细胞表型及功能的一个重要方法。骨髓来源的巨噬细胞相比于细胞株更贴合正常生理状态，同时相比腹腔巨噬细胞更偏向于静息状态，因此该细胞更加适用于巨噬细胞相关实验模型的构建。由于脂质体转染巨噬细胞，容易使其极化，从而影响后续实验结果，因此对于巨噬细胞转染时更多会采用慢病毒转染方式。骨髓来源巨噬细胞不具有增殖能力，为了保证后续实验结果准确，因此需要较高的转染效率。

发明内容：