[发明专利]细胞增殖与毒性检测试剂盒

说明书

本发明公开一种可提高检测灵敏度及稳定性、缩短反应时间、避免漏加检测液的细胞增殖与毒性检测试剂盒，有检测液，所述检测液由WST‑8、2‑甲基‑1,4‑萘醌、氯化钠水溶液、氯化钾水溶液及氯化钙水溶液组成，所述WST‑8与2‑甲基‑1,4‑萘醌的摩尔比为12~18：1，所述氯化钠水溶液、氯化钾水溶液及氯化钙水溶液的浓度分别为8.6g/L、0.3 g/L、0.28g/L；有反应终止液，所述反应终止液为0.05~0.15 mol/L HCl。

技术领域

本发明涉及细胞生物学技术领域，尤其是一种可提高检测灵敏度及稳定性、缩短反应时间、避免漏加检测液的细胞增殖与毒性检测试剂盒。

背景技术

细胞增殖与毒性检测是测定物质毒性、评估药物安全和细胞健康的基本方法，同时可以指示肿瘤细胞增殖活性、目的基因瞬转/稳转细胞系的细胞增殖活性，目的基因过表达或RNAi干扰的基因功能研究，在药物筛选及功能安全性研究中发挥重要作用。因此，细胞增殖与毒性检测技术已广泛应用于分子生物学、肿瘤生物学、免疫学、遗传学、药理和药代动力学等各个研究领域。

目前，细胞增殖检测方法主要包括DNA合成检测、细胞增殖相关抗原检测及代谢活性检测三大类，其代谢活性检测方法是最为常用的方法。早期的代谢活性检测方法包括MTT法、XTT法、MTS法及WST-1法等，即检测试剂盒中分别含有MTT、XTT、MTS及WST-1检测液。MTT（四甲基偶氮唑盐）法的原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜并沉积在细胞中（而死细胞无此功能），将结晶溶解后，测定570nm波长吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比，吸光度越大，表示细胞活性越强，说明药物毒性越小。MTT法虽具有操作方便快捷、灵敏、无放射性等优点，但由于需要溶解甲臜产物，有时会因甲臜溶解不全或者带出而造成结果偏差，故重复性差，并且具有细胞毒性。

XTT（四氮唑衍生物）法与MTT原理相似，经活细胞线粒体脱氢酶作用，XTT被还原成水溶性的棕黄色甲臜，在电子偶合剂硫酸酚嗪甲脂（PMS）存在时，棕黄色甲臜的生成量与活细胞数量呈正相关。但是由于XTT本身不易溶解且溶液不稳定，因此限制了其应用。

MTS法和WST-1法与XTT原理相似，它们需要PMS存在，但是克服了MTT和XTT的缺点，具有更高的灵敏度和特异性，但是MTS或WST-1需要与PMS分开配制，使用时再按比例混合，增加了操作的复杂性。

WST-8[2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium]是近年来开发的一种较WST-1更新的水溶性四氮唑盐，使用原理与前述方法相似，在电子耦合剂（如PMS）存在的条件下，可以被线粒体内的脱氢酶还原为具有高度水溶性的橙黄色甲臜产物，生成的甲臜数量与活细胞的数量成正比，细胞增殖越多越快则颜色越深；细胞毒性越大则颜色越浅。这种方法灵敏度更高，甲臜溶解性更好、更稳定、更易保存，且WST-8与PMS可配制成一种试剂，使用时更方便。但是，基于WST-8检测的试剂盒依旧存在如下缺陷：含有PMS的检测液为与培养基颜色相同的粉色，容易造成检测液漏加或多加；没有配套的反应终止试剂，无法控制反应时间，不适合做大批量的药物筛选；检测液的稳定性较差，较高温度保存或运输时易变质；反应时间及检测灵敏度需要进一步改善。

发明内容

本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种可提高检测灵敏度及稳定性、缩短反应时间、避免漏加检测液的细胞增殖与毒性检测试剂盒。

本发明的技术解决方案是：一种细胞增殖与毒性检测试剂盒，有检测液，其特征在于所述检测液由WST-8、2-甲基-1,4-萘醌、氯化钠水溶液、氯化钾水溶液及氯化钙水溶液组成，所述WST-8与2-甲基-1,4-萘醌的摩尔比为12~18：1，所述氯化钠水溶液、氯化钾水溶液及氯化钙水溶液的浓度分别为8.6g/L、0.3 g/L、0.28g/L；有反应终止液，所述反应终止液为0.05~0.15 mol/L HCl。