[发明专利]一种抗真菌蛋白β-1,3-葡聚糖酶和含有该基因的工程菌及其应用

说明书

本发明公开了一种β‑1,3‑葡聚糖酶基因、含有该基因的工程菌及其在抗真菌方面的应用。本发明提供了一种抗真蛋白β‑1,3‑葡聚糖酶基因，其核苷酸序列为：SEQ ID NO.1。所编码的β‑1,3‑葡聚糖酶氨基酸序列为：SEQ ID NO.2。利用该基因构建的毕赤酵母工程菌株能高效表达β‑1,3‑葡聚糖酶，该酶以昆布多糖为底物时其比活力高达10.8 U/mg。该β‑1,3‑葡聚糖酶能有效的水解真菌的细胞壁，如安琪酵母和稻瘟病菌，进而抑制稻瘟孢子的萌发和附着孢的形成，展现出良好的抗真菌活性。利用基因生产的酶制剂可用于农业上植物病原真菌的生物防治，在解决实际问题的同时还可以取得可观的经济效益。

技术领域

本发明属于应用工业微生物领域，公开了一种新的抗真菌蛋白β-1,3-葡聚糖酶、含有该基因的工程菌及其在抗真菌方面的应用。

背景技术

β-葡聚糖(β-Glucan)是一类非淀粉性多糖(NSP)，由D-葡萄糖单元通过的β-糖苷键连接的同聚糖。广泛分布于植物、藻类、细菌、真菌及酵母等细胞壁中。β-1,3-葡聚糖酶是一类能特异性作用于β-1,3-葡聚糖中的β-1,3-糖苷键的糖苷水解酶，又称为海带多糖酶或昆布多糖酶(Laminarinase)。β-1,3-葡聚糖酶可以水解植物病原真菌细胞壁最外层的β-1,3-葡聚糖，导致细胞壁骨架受损，从而抑制病原真菌的生长与增殖。因此，近年来β-1,3-葡聚糖酶是研究最多、应用最广泛的抗真菌蛋白之一，其抗真菌具有广谱性、持久性的特点。

β-1,3-葡聚糖酶的来源广泛，在自然界中的真菌、细菌、古菌、放线菌、藻类、昆虫、低等动物、植物甚至病毒中都存在。目前，微生物来源的β-1,3-葡聚糖酶已经在工业酶制剂中得到广泛的应用，包括来源于真菌的有哈茨木酶(Trichoderma harzianum)、无根根霉菌(Rhizopus arrhizus)、香菇(Lentinula edodes)、米曲霉(Aspergillus oryzae)等，来源于细菌的有枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)、链霉菌(Streptomyces sp.)等，来源于古菌的有Pyrococcus furiosus。Liangwu Sun等还从小球藻病毒(Chlorella virus PBCV-1)克隆到一个属于GH16家族的β-1,3-葡聚糖酶A94L，并对其酶学性质进行了研究。

β-1,3-葡聚糖酶的应用范围广泛，包括在真菌细胞壁的结构分析、原生质体的制备等科学研究方面；植物病原真菌的防治等农业及生态保护方面及酵母提取物的制备、饲养业和酿造业等工业生产方面。目前许多体外抑菌试验表明，无论内切型还是外切型的β-1,3-葡聚糖酶对病原真菌细胞壁都具有不同程度的水解作用。Fridlender等从Pseudomonas cepacia中纯化到一个内切型的β-1,3-葡聚糖酶，该酶对立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)、腐霉(Pythium ultimwn)等菌丝的生长具有良好的抑制作用，生防效果分别达到85%、48%和71%。Donzelli等从生防菌哈茨木酶(T. harzianum)中克隆到一个具有生防作用的外切型的β-1,3-葡聚糖酶GLUC78基因。另外，外源β-1,3-葡聚糖酶基因可以通过转基因技术导入到农作物中，从而提高农作物对病原真菌的抗性。β-1,3-葡聚糖酶还可以运用于酵母细胞壁葡聚糖结构的分析、酵母原生质体的制备、酵母功能性多糖提取等。同时，在饲料中添加β-1,3-葡聚糖酶和植酸酶等，可以消除饲料中抗营养作用，提高家禽对营养物质的消化利用以及改善调节家禽肠道微生态菌等作用。