[发明专利]一种基于二茂铁作为电子供体的适配体生物传感器制备方法及应用

说明书

一种基于二茂铁作为电子供体的适配体生物传感器制备方法及应用，步骤如下：在活化羧基的氧化石墨烯溶液中加入壳聚糖溶液，然后将该混合溶液修饰在丝网印刷碳电极表面；适配体末端添加特定碱基对设计合成发卡结构，并在两端分别修饰氨基和二茂铁，通过酰胺键的形成将该适配体链有效固定在氧化石墨烯‑壳聚糖/丝网印刷碳电极表面；适配体与目标物的特异性识别诱导适配体构象改变，从而导致二茂铁在磷酸盐缓冲溶液中产生的电流信号发生变化，进而对目标物进行监测。本发明能实现丙溴磷、甲拌磷、水胺硫磷、氧乐果四种有机磷农药的超灵敏检测，检测时间短，检测限低，为有机磷农药以及其他领域有害物质的检测提供了一种新技术。

技术领域

本发明涉及一种基于二茂铁作为电子供体的适配体生物传感器制备方法及应用，属于电化学生物传感器检测技术领域。

背景技术

有机磷农药是一种含磷有机化合物，因其高效、低毒、低残留的优点，在农业上被广泛用于防治病虫害和杂草。这些农药的使用可以帮助防止农作物损失。但农产品上残留的过量的有机磷农药可通过食物链进入人体，与乙酰胆碱酯酶结合造成神经功能紊乱，导致瘫痪甚至死亡，对人类健康造成极大危害。丙溴磷、甲拌磷、水胺硫磷和氧乐果是被广泛使用的有机磷农药，在蔬菜产品中经常发生其超标事件。因此，构建一种快速、灵敏、安全可靠的农药残留检测分析方法是十分必要的。

在过去的几十年中，已经建立了各种有效的有机磷农药残留检测方法，例如，气相色谱法、高效液相色谱法、酶联免疫吸附法、比色法、荧光法等。但它们大多耗时费力、仪器设备昂贵，操作人员技术要求高，不适用于现场快速分析。为了改善这些问题，电化学适配体传感器由于其良好的选择性、高的灵敏度和价格低廉等优点而得到广泛应用。在电化学适配体传感器的应用过程中，电化学信号的产生与放大是制约传感器灵敏度等性能的关键因素。

氧化石墨烯是众所周知的优异导电纳米材料，它与壳聚糖溶液的结合在放大电化学信号的同时也为生物识别分子提供良好的生物相容性和稳定性。二茂铁是一种有机过渡金属化合物，由于其优良的可逆氧化还原性能和良好的化学稳定性而被广泛用作电化学信号探针。近年来，有文献报道它在磷酸盐缓冲液中可提供电子，由此产生的电化学信号具有超高灵敏性。因此，利用上述材料有望开发一种超灵敏的电化学适配体传感器并用于有机磷农药检测。

发明内容

本发明的目的在于提供一种灵敏度高、操作简单、选择性好的适配体生物传感器，并用于丙溴磷、甲拌磷、水胺硫磷、氧乐果四种有机磷农药的检测。

本发明的技术方案为：在表面修饰有氧化石墨烯-壳聚糖复合薄膜的丝网印刷碳电极表面固定二茂铁标记的发卡适配体，构成适配体生物传感器；包括电极的预处理、氧化石墨烯-壳聚糖溶液的制备、适配体发卡结构的设计与标记、有机磷农药的检测，具体步骤为：

（1）电极的预处理：将丝网印刷碳电极工作区域完全浸入0.5 M硫酸溶液中，在-1.0～+1.0 V电势范围内进行5圈循环伏安扫描，以得到性能稳定电极；

（2）氧化石墨烯-壳聚糖溶液的制备：氧化石墨烯溶液中加入EDC和NHS，室温条件下孵育活化氧化石墨烯上的羧基，离心清洗后加入壳聚糖溶液，制备1 mg/mL氧化石墨烯-壳聚糖溶液；

（3）适配体发卡结构的设计与标记：在适配体（5′-AGCTTGCTGCAGCGATTCTTGATCGCCACAGAGCT-3′）的3′端添加与5′端前几个碱基对（AGCTTG）互补配对的碱基对CAAGCT，并在两端分别标记氨基（-NH₂）和二茂铁（Fc），新合成的适配体链（NH₂-AGCTTGCTGCAGCGATTCTTGATCGCCACAGAGC TCAAGCT-Fc）能够有效形成发卡结构；