[发明专利]一种基因敲除选育bai2基因缺失型斑马鱼的方法

说明书

本发明涉及基因敲除技术领域，特别是公开了一种基因敲除选育bai2基因缺失型斑马鱼的方法，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，在斑马鱼的bai2基因上设计合适的打靶位点，在体外合成的特异性gRNA，显微共注射进入斑马鱼一细胞内，胚胎培养50h后，通过选取胚胎进行基因型分析，从而证实了所选位点的有效性。本发明能更高效且更精确地在生物体基因组中沉默特定基因，且制作简单、成本低，还可同时对靶基因上多个位点进行剪切，沉默任意数目的单个基因。干扰bai2基因的表达，并且通过遗传学手段研究其功能，有助于进一步揭示心脏形态发生的整个过程以及调控这些过程的分子机制，在医学上心脏疾病病理的理解和新的治疗方案的研发中具有十分重要的意义。

技术领域

本发明涉及基因敲除领域，特别是公开了一种基因敲除选育bai2基因缺失型斑马鱼的方法。

背景技术

bai2（又称adgrb2，adhesion G protein-coupled receptor B2）基因位于斑马鱼第19号染色体上，包含14个外显子，cDNA全长1904bp，同时通过基因差异表达谱分析和基因组关联分析等，发现bai2基因在人类胚胎早期的多个组织中都有表达，特别的是，该基因与斑马鱼左右不对称发育密切相关。

斑马鱼与人类心脏发育过程中的基因、信号通路有高度同源性，且bai2基因进化上较为保守，研究发现bai2在斑马鱼胚胎早期表达量较高。而且，与其他动物模型相比，斑马鱼具有个体小、易于饲养、发育快、繁殖能力强、体外受精、胚胎体外发育且透明等优点。

基因打靶技术起源于20世纪80年代末，是一种通过对基因组进行定点修饰来研究基因功能的重要方法手段，也可用于治疗人类的各种遗传性疾病。该技术主要是利用缺失突变、基因灭活、染色体大片段删除以及外源基因导入等方式来改变生物的遗传信息，并且在生殖系中稳定遗传后表达突变性状，从而研究生物体内特定基因在生长发育过程中的作用，所以这类技术手段已成为现代分子生物学研究热点。传统的基因打靶技术是建立在胚胎干细胞(ESC) 和同源重组技术的基础之上，故打靶技术效率极低。2013年初，一种全新的人工核酸内切酶clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)9，该技术具有操作简单、成本低的特点，能更高效、更精确地在生物体基因组中沉默特定基因，且可同时对靶基因上多个位点进行剪切，沉默任意数目的单个基因，但与此同时，该技术存在一定的缺陷，其脱靶率相对较高。

发明内容

针对现有基因打靶技术中存在的脱靶率相对较高问题，本发明提供了一种基因敲除选育bai2基因缺失型斑马鱼的方法，能更高效且更精确地在生物体基因组中沉默特定基因，且制作简单、成本低，还可同时对靶基因上多个位点进行剪切，沉默任意数目的单个基因，脱靶率较低。与此同时，通过研究bai2基因的缺失与其他器官的发育的相关性，这将为医学研究提供更多信息

解决上述技术问题的技术方案如下：

1）分别设计CRISPR/Cas9基因敲除靶位点和检测引物

在National Center for Biotechnology Information（NCBI）上查询斑马鱼bai2基因的基因组DNA序列，在网站SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）上分析其功能结构域，根据CRISPR/Cas敲除原理，在网站The ZiFiT Targeter (http://zifit.partners.org/ZiFiT/) 上设计bai2基因的靶位点；

两对特异性靶位点PCR 引物如下：

F1（靶位点a正向引物）：

TGTAATACGACTCACTATAggtacggctccttctcgctcGTTTTAGAGCTAGAAATAGC