[发明专利]一种鹰嘴豆乳内产GABA的乳酸菌菌株的筛选方法

权利要求书

1.一种鹰嘴豆乳内产GABA的乳酸菌菌株的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)制备鹰嘴豆乳块与水的混合液；

2)采用纸层析法分离混合液中的氨基酸；

3)使用高效液相色谱仪判断混合液中产GABA的乳酸菌；

4)对混合液中产GABA的乳酸菌进行形态学鉴定；

5)对混合液中产GABA的乳酸菌进行生理生化试验；

6)使用16SrDNA序列鉴定混合液中产GABA的乳酸菌的菌株；

7)对步骤2)至6)的检测结果进行对比分析，筛选出混合液中产GABA的乳酸菌菌株。

2.根据权利要求1所述的一种鹰嘴豆乳内产GABA的乳酸菌菌株的筛选方法，其特征在于，步骤1)中，将鹰嘴豆乳块与水混合，并搅拌均匀后，在25～40℃的环境中静置10min。

3.根据权利要求1所述的一种鹰嘴豆乳内产GABA的乳酸菌菌株的筛选方法，其特征在于，步骤2)具体步骤包括：首先，在滤纸条上端边缘约1厘米的中央剪一小孔，将滤纸条平放于洁净的纸上，在距离滤纸下端25mm处用铅笔轻画一横线，并在横线的中央画一直径为2mm的小圆圈，用毛细管吸取步骤1)中混合液，在滤纸条下端的小圆圈内点样，取干燥大试管，加入被水饱和的酚溶液，在距滤纸条下端12.5mm处穿大头针，从滤纸条上端小孔处穿棉线并左右分开，调节线的高度使滤纸垂直悬于试管内且下湍浸入溶液12.5mm，此时即可看到溶剂向上移动，溶剂升到一定高度时，小心将纸条取出，以铅笔标出溶剂上升的前沿，将滤纸条两端，用大头针钉在小木框上，吹干后用喷雾器均匀地喷一层0.2％茚三酮乙醇溶液，然后再将滤纸条吹干，即可看到纸上显出各个色点，每个色点代表一种氨基酸。

4.根据权利要求1所述的一种鹰嘴豆乳内产GABA的乳酸菌菌株的筛选方法，其特征在于，步骤3)包括：

3.1)产GABA的乳酸菌的初次判断：使用高效液相色谱仪将步骤1)制备的混合液抽入进样阀，由流动相带入色谱柱内，在柱内的各个氨基酸成分被分离后，依次进入检测器进行检测，高效液相色谱仪内部的记录装置经过对比分析将GABA的各项数据记录下来；

3.2)产GABA的乳酸菌的二次判断：取步骤1)中混合液静置20-24h，再次使用高效液相色谱仪进行检测，记录下GABA的各项数据，通过对比数据观察GABA的量增加。

5.根据权利要求1所述的一种鹰嘴豆乳内产GABA的乳酸菌菌株的筛选方法，其特征在于，步骤4)包括：取步骤1)中制备的混合液放入光学显微镜下，通过形态学鉴定，观察培养特征、细胞形态及其染色特性、特殊的细胞结构、运动性，与常规GABA进行对比，鉴定混合液中存在产GABA的乳酸菌的菌株。

6.根据权利要求1所述的一种鹰嘴豆乳内产GABA的乳酸菌菌株的筛选方法，其特征在于，步骤5)包括：取步骤1)中制备的混合液进行糖、醇发酵试验，通过不同微生物分解利用糖类的能力有很大差异，来鉴别GABA，再提取步骤1)中制备的混合液进行耐盐试验，最后提取步骤1)中制备的混合液进行不同温度试验，确定产GABA的乳酸菌的存在。

7.根据权利要求1所述的一种鹰嘴豆乳内产GABA的乳酸菌菌株的筛选方法，其特征在于，步骤6)包括：取步骤1)中制备的混合液，采用细菌总DNA提取试剂盒提取基因组DNA，采用细菌的16S rDNA通用引物进行PCR扩增，PCR结束后，吸取PCR产物5μL与1μL loadingbuffer混合，用1.0％的琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后用溴化乙锭EB染色20～30min，PCR产物经纯化后测序，将16S rDNA序列与GenBank数据库中的核苷酸序列进行同源性分析，对产GABA的乳酸菌进行鉴定。

8.根据权利要求7所述的一种鹰嘴豆乳内产GABA的乳酸菌菌株的筛选方法，其特征在于，所述琼脂糖凝胶电泳所需的电压为100V。