[发明专利]抗肥胖药物靶点UCP1的基因工程细胞株和高通量药物筛选模型的建立及应用

权利要求书

1.一种利用CRISPR-Cas9系统构建UCP1启动子区域敲入荧光素酶luciferase和红色荧光蛋白tdTomato稳转细胞株的方法，其特征在于，所述方法为：(1)确定打靶策略，在分析靶基因UCP1基因结构后，设计在UCP1基因N端ATG之后敲入luciferase-T2A-tdTomato-WPRE-pA-loxP-Neo-loxP,替换exon1和部分intron1；(2)靶序列的测序确认，设计靶位点测序引物，对靶细胞系的靶位点序列进行PCR扩增并测序验证，以保证sgRNA识别序列与靶细胞系DNA序列完全一致；(3)Cas9/sgRNA设计，基于sgRNA的设计原则，在5’端和3’端靶位点区域各设计5条sgRNA；(4)Cas9/sgRNA质粒的构建，按照已设计sgRNA序列合成相应引物，通过Gibson Assembly的方式连入pCS-3G载体，连接产物转化后送样测序验证正确；(5)Cas9/sgRNA的活性检测，综合考虑活性、特异性因素选择UCP1-sgRNA1和UCP1-sgRNA6进行下一步实验；(6)重组外源基因载体构建，合成LR-A片段，设计引物克隆RR片段，并将LR-A片段及RR片段与载体LScKO-4G连接为重组外源基因载体UCP1-LScKO-4G-Neo-LR-A-RR，经过酶切鉴定和测序，确认重组外源基因载体构建完成；(7)阳性克隆筛选，UCP1-sgRNA1、UCP1-sgRNA6和重组外源基因载体转染靶细胞系，经过G418药物抗性筛选、细胞富集、PCR筛选，得到阳性克隆；

所述靶细胞系为永生化棕色脂肪细胞系；

所述外源基因为luciferase-T2A-tdTomato-WPRE-pA基因；

所述的sgRNA对应的靶向序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ IDNO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11和SEQ IDNO.12所示；

所述的UCP1-sgRNA1序列如SEQ ID NO.13所示、UCP1-sgRNA2序列如SEQ ID NO.14所示、UCP1-sgRNA3序列如SEQ ID NO.15所示、UCP1-sgRNA4序列如SEQ ID NO.16所示、UCP1-sgRNA5序列如SEQ ID NO.17所示、UCP1-sgRNA6序列如SEQ ID NO.18所示、UCP1-sgRNA7序列如SEQ ID NO.19所示、UCP1-sgRNA8序列如SEQ ID NO.20所示、UCP1-sgRNA9序列如SEQID NO.21所示、UCP1-sgRNA10序列如SEQ ID NO.22所示；

选择使用的sgRNA为UCP1-sgRNA1和UCP1-sgRNA6，序列如SEQ ID NO.13和SEQ IDNO.18所示，pCS-sgRNA1与pCS-sgRNA6核苷酸序列如SEQ ID NO.23与SEQ ID NO.24所示；

外源基因RR片段的克隆引物序列如SEQ ID NO.25与SEQ ID NO.26所示，重组外源基因载体核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶位点测序引物序列如SEQ ID NO.1与SEQ ID NO.2所示。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，Cas9/sgRNA质粒载体为pCS-3G载体。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，重组外源基因的质粒载体为LScKO-4G。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，限制性酶切分析所用的限制性核酸内切酶分别为Scal、Smal、Sall、EcoRV或Ncol。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，筛选混合克隆PCR引物UCP1-L-GT-F序列如SEQ ID NO.28所示、WPRE-120R序列如SEQ ID NO.29所示、tdTomato-2371F序列如SEQ IDNO.30所示、UCP1-R-GT-R序列如SEQ ID NO.31所示。