[发明专利]一种一步法PCR检测禽白血病病毒A/B/J/K亚群引物组及试剂盒

说明书

本发明涉及一种一步法PCR检测禽白血病病毒A/B/J/K亚群引物组及试剂盒，其特征在于包括禽白血病病毒A/B/J/K亚群的检测引物组和由禽白血病病毒A/B/J/K亚群的引物组所扩增出核苷酸序列制备的ALV‑A、ALV‑B、ALV‑J、ALV‑K亚型病毒阳性对照质粒和阴性对照，能够快速、特异、敏感、高效的检测禽白血病，并区分禽白血病A/B/J/K亚群，适用于禽白血病流行病学调查，有助于禽白血病的净化。

技术领域

本发明涉及一种一步法PCR检测禽白血病病毒A/B/J/K亚群引物组及其试剂盒，属于分子生物学技术领域。

背景技术

禽白血病是由反转录病毒科禽反转录病毒属的禽白血病病毒（Avian leukosisvirus，ALV）引起的造血细胞增生为主的一类肿瘤性疾病。可以通过水平和垂直两种方式传染易感鸡群。根据病毒干扰模式、宿主范围和囊膜糖蛋白的不同，将ALV分为A-J 10个亚群，其中鸡源禽白血病病毒包含A、B、C、D、E和J 6个亚群。E亚群为内源性禽白血病病毒，没有致瘤性。A、B、C、D、J亚群为外源性禽白血病病毒，能诱发机体产生肿瘤引起死亡和生产性能下降。C、D亚群相对罕见且临床症状不明显，而A、B和J亚群是目前流行最广，是导致鸡群ALV发病的优势亚群，在许多禽类养殖场中十分常见。另外，2012年我国又分离鉴定到了新的亚群，即K亚群。近几年来ALV- K在我国的检出率呈上升趋势，且可能在我国多个地方鸡种中长期存在。

近几年禽白血病的流行和爆发给我国养禽业带来了严重的经济损失，目前临床上尚无可用的ALV疫苗及有效的药物。控制ALV传播的唯一手段是检测阳性鸡，并严格淘汰，最终得到纯净的种群。因而，准确、快速、实用的检测方法对禽白血病的防控至关重要。多重PCR检测方法快速、特异性好、敏感性高，适用于禽白血病流行病学调查，有利于临床监测以及禽白血病的净化工作。

发明内容

本发明第一个目的是提供一种一步法PCR检测禽白血病病毒A/B/J/K亚群的引物组核苷酸序列，包括引物Pl、P2、P3、P4和P5；其中P1为上游通用检测引物；P2为检测ALV-A亚型病毒的下游引物；P3为检测ALV-B亚型病毒的下游引物；P4为检测ALV-J亚型病毒的下游引物；P5为检测ALV-K亚型病毒的下游引物；由所述的引物组进行扩增出的目的核苷酸序列，为序号（1）或（2）或（3）中任意一种所述核苷酸序列：

（1）SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、 SEQ ID NO.4中所示的目的核苷酸序列；

（2）与（1）中所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列；

（3）与上述（1）或（2）所述核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列；可在一个PCR反应中即可快速、准确地检测禽白血病病毒并区分亚群。

本发明另一个目的是提供一种一步法PCR检测禽白血病病毒A/B/J/K亚群试剂盒，包括引物组、由禽白血病病毒A/B/J/K亚群的引物组所扩增出的目的核苷酸序列克隆至pMD-18-T载体所得的ALV-A、ALV-B、ALV-J、ALV-K亚型病毒阳性对照质粒和阴性对照；所述试剂盒反应体系包括：PCR-Mix 25 μl；dd H₂O 6 μl；浓度10 pmol/μl的上游引物6μl、下游引物各2 μl; cDNA 5 μl；所述试剂盒反应条件包括：预变性95 ℃，4 min；再经95 ℃变性45 s，56 ℃退火35 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；最后72 ℃延伸10 min。其灵敏度高，特异性好，成本低，能够简便快速地对规模化种鸡场禽白血病病毒进行分型检测，大大降低了禽白血病的检测时间及成本。

本发明的技术方案是这样实现的：一种一步法PCR检测禽白血病病毒A/B/J/K亚群的引物组核苷酸序列，其特征在于包括引物Pl、P2、P3、P4和P5；其中P1为上游通用检测引物；P2为检测ALV-A亚型病毒的下游引物；P3为检测ALV-B亚型病毒的下游引物；P4为检测ALV-J亚型病毒的下游引物；P5为检测ALV-K亚型病毒的下游引物；