[发明专利]一种卤醇脱卤酶突变体及其应用在审
| 申请号： | 201811254973.2 | 申请日： | 2018-10-26 |
| 公开（公告）号： | CN109295044A | 公开（公告）日： | 2019-02-01 |
| 发明（设计）人： | 吴坚平;王露;徐刚;杨立荣 | 申请（专利权）人： | 浙江大学 |
| 主分类号： | C12N9/88 | 分类号： | C12N9/88;C12N15/60;C12N15/70;C12N1/21;C12P13/00;C12R1/19 |
| 代理公司： | 杭州天勤知识产权代理有限公司 33224 | 代理人： | 沈自军 |
| 地址： | 310013 浙江*** | 国省代码： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 替换 苏氨酸 卤醇脱卤酶突变体 半胱氨酸 天冬酰胺 精氨酸 丝氨酸 突变体 组氨酸 缬氨酸 酶活 位点 突变 饱和 卤醇脱卤酶 苯丙氨酸 定向进化 活性位点 理性设计 实验策略 随机组合 突变策略 异亮氨酸 丙氨酸 亮氨酸 原始酶 迭代 应用 筛选 改造 发现 | ||
1.一种卤醇脱卤酶突变体，其特征在于，所述卤醇脱卤酶突变体为下列(1)～(4)中的一种或两种以上的组合；
(1)将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第84位的精氨酸替换为丙氨酸、丝氨酸、组氨酸或天冬酰胺；；
(2)将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第88位的精氨酸替换为亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸或异亮氨酸；
(3)将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第136位的缬氨酸替换为苏氨酸或丝氨酸；
(4)将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第144位的天冬酰胺替换为半胱氨酸、组氨酸或苏氨酸。
2.如权利要求1所述的卤醇脱卤酶突变体，其特征在于，所述卤醇脱卤酶突变体为下列(A)～(E)中的一种；
(A)将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第88位的精氨酸替换为亮氨酸，第136位的缬氨酸替换为苏氨酸；
(B)将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第88位的精氨酸替换为亮氨酸，第136位的缬氨酸替换为苏氨酸，第144位的天冬酰胺替换为半胱氨酸；
(C)将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第84位的精氨酸替换为丝氨酸，第88位的精氨酸替换为亮氨酸，第136位的缬氨酸替换为苏氨酸；
(D)将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第84位的精氨酸替换为丝氨酸，第88位的精氨酸替换为亮氨酸，第136位的缬氨酸替换为苏氨酸，第144位的天冬酰胺替换为半胱氨酸；
(E)将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第88位的精氨酸替换为苯丙氨酸，第136位的缬氨酸替换为丝氨酸，第144位的天冬酰胺替换为半胱氨酸。
3.一种如权利要求1或2任一项所述卤醇脱卤酶突变体的编码基因。
4.一种包含权利要求3所述编码基因的表达载体。
5.一种包含权利要求3所述编码基因的基因工程菌。
6.如权利要求1或2任一项所述的卤醇脱卤酶突变体或权利要求5所述的基因工程菌在催化(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯制备(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，包括：以卤醇脱卤酶突变体或基因工程菌为催化剂，催化(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯和NaCN进行脱卤氰化反应，反应结束后，经分离纯化，得到(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述脱卤氰化反应的温度为30～60℃，pH为5.5～10。
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