[发明专利]一种不同淡水环境中铜离子对斜生栅藻毒性效应的确定方法及应用

权利要求书

1.一种不同淡水环境中铜离子对斜生栅藻毒性效应的确定方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)生物毒性实验设计：

对斜生栅藻进行急性毒性实验，在BG11培养基中分别外加CaCl₂、MgSO₄、NaCl、KCl、HCl、NaOH和生物缓冲液MOPS并采用控制变量法，在只改变某个实验条件的同时控制其他实验条件不变的情况下，对斜生栅藻进行急性毒性实验，测试媒介为一般地表水水质；

(2)确定斜生栅藻毒性参数并计算溶液中各离子活度：

毒性实验结束后，计算各组实验生长抑制率，计算方程为：

其中，I为斜生栅藻的生长抑制率，A_c代表对照组的吸光度，A_s代表实验组的吸光度；

得到I值后，用SPSS软件拟合得到EC₅₀，选择Logit模型；

各阳离子的自由态离子活度通过输入水质参数和EC₅₀到Biotic Ligand ModelInterface,Research(Version 3.1.2.37)程序中“Speciation”模式形态分布功能计算得到；

(3)构建毒性预测模型：

根据生物配体模型中基于淡水中阳离子会在生物配体上发生竞争作用，可将生物配体络合容量表达为：

CC_BL＝∑_i[C_iBL]+[BL^-] (2)

其中，CC_BL为生物配体的络合容量，[C_iBL]表示溶液中各阳离子与生物配体的络合物的浓度，[BL^-]表示未与阳离子发生络合作用的生物配体的浓度；

阳离子和生物配体的络合物的稳定常数的表达式为：

其中，K_CuBL表示铜离子与生物配体的络合物的稳定常数，CuBL⁺表示铜离子与生物配体的络合物的浓度，(Cu²⁺)表示铜离子活度，[BL^-]表示未与阳离子发生络合作用的生物配体的浓度；

联立(2)、(3)方程式可将铜离子与生物配体的络合物的浓度表示为：

[CuBL⁺]＝[K_CuBL·(Cu²⁺)]/[1+∑_iK_CiBL·(C_i)]·CC_BL (4)

其中，i表示与铜离子在生物配体上产生竞争作用的阳离子的个数，K_CiBL表示该离子的稳定常数，(C_i)表示该离子活度；

假设生物配体络合容量不随水质参数而改变，可将铜离子与生物配体的络合物占生物配体络合容量比表达为：

f_CuBL＝[CuBL⁺]/CCBL＝[K_CuBL·(Cu²⁺)]/[1+∑_iK_CiBL·(C_i)] (5)

根据生物配体模型，可假设半数抑制浓度时，生物配体络合容量占比为常数，则可将方程式(5)表达为：

其中，EC50_(Cu2+)表示斜生栅藻72h急性毒性的半数抑制浓度；

在生物配体模型中，如将(CuOH⁺)毒性考虑其中，可将方程(5)转化为：

f_CuBL＝[K_CuBL·(Cu²⁺)+K_CuOHBL·(CuOH⁺)]/[1+∑_iK_CiBL·(C_i)] (7)

并可将方程(6)转化为：

由方程式(6)可知，确定其他阳离子活度不变，只改变i离子活度的情况下以，(C_i)与EC50_(Cu2+)为线性关系，可得方程式(9)、(10)：

其中I_i表示该线性方程的截距，S_i代表该线性方程的斜率；

由方程(9)、(10)可得斜率与截距比为：

通过上述急性毒性试验和Biotic Ligand ModelInterface,Research(Version 3.1.2.37)程序计算不同实验条件下各离子活度可得到EC50_(Cu2+)和(C_i)的线性关系表达式；

通过线性关系分析得知，(K⁺)的变化不影响EC50_(Cu2+)的变化，(Na⁺)、(Mg²⁺)、(Ca²⁺)、(H⁺)与EC50_(Cu2+)呈线性关系，据此，可由方程(12)得到一个矩阵表达式：

其中，(Mg²⁺)_Ca、(Na⁺)_Ca、(H⁺)_Ca表示以Ca浓度为变量实验组中(Mg²⁺)、(Na⁺)、(H⁺)的平均值，其他组别表达相同；

考虑到pH组别的特殊性，预测时分别假设：

a：EC50_(Cu2+)与pH的线性关系全部归因于质子竞争；

b：EC50_(Cu2+)与pH的线性关系与质子竞争无关，与产生的CuOH⁺有关，去掉该矩阵表达式的最后一列；

使用方程(12)所计算出的假设a和假设b稳定常数，将假设a和假设b的结果与文献中已有值进行比较，确定logK_CaBL、logK_MgBL、logK_NaBL和logK_HBL；

根据方程(3)计算K_CuBL并对铜的形态进行分离测定：生物积累实验选取处于对数生长中后期的藻2×10⁶cells·mL^-1，将藻液导入50mL离心管中，3200r/min离心4min后倒掉上清液，再反复2次MOPS缓冲液清洗，使藻悬浮后重新离心并弃掉上清液，然后加入缓冲液至50mL用于生物积累实验；暴露溶液中Cu的浓度范围为3.2μg·L^-1到640.6μg·L^-1，暴露溶液体积为50mL；根据设定浓度，计算出所需母液的含量，进行配制；暴露时间为120min，于t＝120min时取样；取30mL于离心管中，然后将样品3200r/min离心4min，取5mL的上清液于离心管中用于测定溶解铜浓度，然后倒掉上清液，每组实验做三次平行样；分别测定总铜浓度Cu_t、溶解态铜浓度Cu_d和细胞内铜浓度Cu_i，计算细胞外与生物配体络合态铜Cu_BL，测定方法如下：

取藻悬液，3500r/min离心4min后取出5mL上清液测定溶解态铜浓度Cu_d，然后将样品用MOPS缓冲液清洗2到3次，加入20mL EDTA/MOPS溶液重新悬浮10min，3500r/min离心4min后取上清液用于测定细胞外与生物配体络合态铜Cu_BL，将底层沉淀转移至烧杯50mL烧杯中，加入2mL浓硝酸90℃硝化至滤膜完全溶解，后加超纯水稀释至25mL用于测定细胞内Cu_i，用ICP-MS分别对细胞内铜Cu_i和细胞外与生物配体络合态铜Cu_BL进行测定；

由方程(3)可知：

K_BL＝Cu_BL/{Cu_d·([BL^-]-Cu_BL)} (13)

将上式重组可得：

Cu_d/Cu_BL＝Cu_d/[BL^-]+1/K_BL·[BL^-] (14)

由Cu_d/Cu_BL对Cu_d作图，其斜率的倒数为络合容量[BL^-]，截距为络合容量和络合常数乘积的倒数；

可根据线性关系的斜率和截距通过表达式(14)计算得出相应的K_CuBL值；

当金属与斜生栅藻之间的作用常数logK_CaBL、logK_MgBL、logK_NaBL、logK_KBL、logK_CuOHBL、logK_HBL、logK_CuBL确立后，建立了斜生栅藻新的数据(.dat)文件，在无溶解有机质参与的情况下，通过生物配体模型的铜形态分布功能Speciation推算斜生栅藻的半数致死积累量LA₅₀值；

斜生栅藻的LA₅₀值确立后修改(.dat)文件中LA₅₀值，建立斜生栅藻生物配体模型，通过Toxicity模式的预测功能，预测实验条件下斜生栅藻的EC₅₀值。