[发明专利]一种中药制剂的活性成分的筛选方法

说明书

本发明公开了一种中药制剂的活性成分的筛选方法，通过开环反应直接将凝血酶固定在磁珠上，制备得到凝血酶固定化磁珠，用于从复杂的丹参制剂中筛选出潜在的凝血酶抑制剂。本发明与其他方法相比，可以同时分离和富集键合的化合物，使其能够更敏感和快速的对化合物进行筛选，并提供了一种高选择性分离亲和化合物而避免繁琐的凝血酶固定化磁珠与目标分析物的制备方法。此外，原儿茶醛的凝血酶抑制活性为首次报道。方便的酶联技术表明，凝血酶固定化磁珠是一种用于从复杂的丹参制剂中鉴定生物活性化合物的新颖和可行的工具。

技术领域

本发明涉及一种中药制剂的活性成分的筛选方法技术领域。

背景技术

在过去的几十年中，各种亲和筛选方法，包括表型细胞筛选法、细胞荧光素酶报告系统法和基于酶的筛选方法，被广泛地开发和应用于评价复杂药用植物提取物的生物活性。其中，酶键合磁珠法由于具有操作稳定性高、低特异性结合、耦合抗体定位性好、共轭效率高和完好保留酶的结构和活性的优点在生物催化剂、化合物库和酶抑制剂筛选的应用方面受到了极大的关注。常见的酶固定化方法有共价键合、物理吸附和亲和固定。虽然基于亲和选择方法固定的磁珠可以从药用植物中筛选出一些特定的抑制剂，但是不可避免酶共轭技术的固有缺点。更重要的是，磁珠的适宜反应试剂必须通过化学改性研发，这可能是一个昂贵和费时的过程。目前，几乎未报道有在酶固定化方法中利用直接共价键合方法固定化酶的文章。因此，迫切需要开发一种简单的固定化酶的方法，适用于从复杂样品基质中检测活性物质。

凝血酶是一种丝氨酸蛋白酶，可以选择性的裂解纤维蛋白原的精氨酸-谷氨酸键形成纤维蛋白凝块和释放血纤维蛋白肽链。众所周知，凝血酶在血栓症、炎症、凝血、肿瘤的生长和转移等生理和病理过程中起着重要的作用，通常作为诊断某些疾病的生物标志物，如凝血异常、滑膜炎症和肺转移等。因此，抑制凝血酶的活性或防止其产生是最新的抗血栓形成的治疗策略。其目的在于治疗干预血栓性疾病，并且几种方法已经成功应用于有效的凝血酶抑制剂的开发，例如基于配体/受体相互作用的概念的筛选方法。然而，这些方法具有诸如重复性、稳定性和复杂的分离程序等缺点，导致一些活性化合物的缺失。因此，开发一种简单、快速和有效的方法用于凝血酶抑制剂的筛选是十分有意义的。

酚酸是一类含有酚环的有机酸，具体包括单羟基苯甲酸，二羟基苯甲酸和三羟基苯甲酸。据报道，药用植物中的酚酸具有多种生物活性，如抗氧化、抗菌、抗炎、抗缺氧、抗动脉硬化和抗癌。酚酸存在于许多植物中。丹参，为唇形科植物丹参的干燥根茎。它通常单独使用或与其它草药组合用于预防和治疗高血压，高脂血症等多种疾病。丹参注射剂是一种最常用的中药制剂，由丹参提取物制成。其主要活性化合物是各种水溶性酚酸，如丹参素，原儿茶酸，原儿茶醛，咖啡酸和迷迭香酸。药理研究表明，丹参中的酚酸可以抑制血小板凝固、清除氧自由基、保护心脏微血管内皮细胞、抑制血栓形成、调节致突变活性、保护心肌免受局部缺血。因此，从丹参制剂中筛选活性血液循环成分，对临床应用和新药研发具有重要意义。

发明内容

本发明的目的就在于提供一种新的中药制剂活性成分的筛选方法及其采用的凝血酶固定化磁珠。该方法重复性好、稳定性高，能从复杂的中药制剂中鉴定和筛选出生物活性化合物。

一种凝血酶固定化磁珠的制备方法，包括如下步骤：

1)取适量空白磁珠于离心管中，用缓冲液清洗；

2)在离心管中加入凝血酶溶液，混合均匀；然后加入硫酸铵溶液，旋转孵育；

3)孵育结束后，移除离心管中的上清液，然后清洗磁珠，最后把键合后的凝血酶固定化磁珠重新分散在缓冲液中保存。

所述的磁珠用量，优选为1-2.5mg/30μg凝血酶，最优选为1.5mg/30μg凝血酶，此时凝血酶的键合率达到理想化的数值。

步骤1)中所述的缓冲液优选为0.1M磷酸钠缓冲液。进一步，在清洗空白磁珠后加入适量磷酸钠溶液。