[发明专利]一种Bt蛋白仿生亲和材料及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种Bt蛋白仿生亲和材料，属于化学与材料领域，它是模拟Bt Cry1Ac蛋白与烟草天蛾中肠刷状缘膜囊受体钙粘蛋白Bt‑R1之间的分子识别机制，以人工合成的丙烯酰胺‑多肽‑酰胺单体与其它共存单体反应后得到的聚合物纳米颗粒，所述多肽包含有NITIHITDTNNK的氨基酸序列。本发明具有昆虫受体类钙粘蛋白Bt‑R1的仿生特点，当其与Bt Cry1Ac蛋白作用时，可以模拟Bt‑R1的识别机理，通过其侧链结构中的NITIHITDTNNK与Bt Cry1Ac蛋白的抗原表位³⁶⁸RRPFNIGINNQQ³⁷⁹结合在一起。该材料对同源性很高的Bt Cry族蛋白均具有非常强的特异性亲和能力，并且具有吸附容量高，吸附平衡速度快，吸附‑解吸过程易于控制等优点，可以用于多种Bt蛋白的特异性识别、分离和富集。

技术领域

本发明属于化学与材料领域，涉及一种Bt蛋白仿生亲和材料及其制备方法，本发明还涉及一种以所述Bt蛋白仿生亲和材料为吸附剂，对土壤Bt蛋白进行提取分离的方法。

背景技术

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)是一种好氧型革兰氏阳性细菌、呈杆状、内生芽孢，是一种重要的杀虫细菌。Bt蛋白是苏云金芽孢杆菌菌体生长进入稳定期，在芽孢周围形成的菱形或者双锥形的伴孢晶体蛋白(parasporal crystalprotein)，又称为杀虫晶体蛋白(Insecticidal crystal protein,ICP)或δ-内毒素。

环境和生物介质中Bt蛋白的定性和定量检测方法主要有：生物测定法、凝胶电泳法、免疫检测法(包括酶联免疫吸附测定法，免疫印迹分析法、胶体金免疫层析试纸条法)。酶联免疫吸附测定法是目前应用最广的免疫快速检测方法，具有较高的灵敏度，可同时对大量样本进行检测等优点。该方法首先需要使用缓冲溶液将土壤、叶片或种子中的Bt蛋白提取到水相中，然后再采用试剂盒进行定性分析和定量检测。目前采用的提取方法主要有PBST法、碳酸盐法、SDS提取法以及人造蠕虫肠道蛋白提取法。其中PBST、碳酸盐和 SDS提取法的提取效率普遍偏低、而人造蠕虫肠道蛋白提取法则存在提取成本高的问题。尽管酶联免疫吸附法具有较高的灵敏度，但是对于Bt蛋白含量较低、样品基体吸附很强的土壤样品来说，仍然很难避免由于Bt蛋白提取效率低、基质干扰严重所造成的“假阴性”结果。因此，研制出一种对Bt蛋白具有特异性分子识别能力的亲和配体，建立一套有效的分离纯化和样品前处理方法，对于环境和转基因作物中Bt蛋白的有效监控具有十分重要的意义。

聚合物纳米颗粒是通过疏水性、亲水性以及带电性功能单体之间的自由基引发聚合得到的，其对目标蛋白的识别机理主要基于聚合物侧链结构中的疏水性、亲水性以及带电荷基团与蛋白质氨基酸侧基之间存在的疏水作用、氢键作用、静电作用、π-π堆积作用、π-阳离子相互作用以及范德华力等。这种结合力与天然生物大分子之间(酶-底物、酶-辅基、抗原-抗体、激素-受体)互补的多重相互作用原理是一致的。因此，可以通过调节功能单体的种类和配比，使合成的聚合物纳米颗粒具有与目标生物大分子相匹配的侧链结构以及表面化学性质，从而实现其对目标生物大分子的特异性识别和捕获。目前，人工合成聚合物纳米颗粒作为一种理想的仿生亲和配体，在蛋白质分离纯化、生物毒素去除、热激蛋白保护以及生物大分子样品前处理等方面显示出广阔的应用前景。