[发明专利]一种重组克雷伯氏肺炎杆菌及其应用

说明书

本发明提供了一种重组克雷伯氏菌肺炎杆菌及其应用。本发明的重组克雷伯氏菌肺炎杆菌PdhR基因编码的蛋白功能失活，将该菌用于发酵甘油生产1,3‑丙二醇，能够提高厌氧或微氧条件下1，3‑丙二醇的产量和得率，有效减低发酵成本，在1，3‑丙二醇生产领域具有良好的应用前景。

技术领域

本发明属于基因工程和微生物发酵技术领域，具体地说，本发明涉及一种PdhR基因失活的重组克雷伯氏菌肺炎杆菌及其在发酵甘油提高1,3-丙二醇产量或得率中的应用。

背景技术

1,3-丙二醇是一种重要的二元醇，主要用作单体与对苯二甲酸聚合生产新型的聚酯材料聚对苯二甲酸丙二醇脂(PTT)。1，3-丙二醇可以通过微生物发酵的方法，利用天然的微生物如克雷伯氏肺炎杆菌、丁酸梭菌等将甘油转化成1，3-丙二醇。由于克雷伯氏肺炎杆菌具有甘油代谢速率快、1，3-丙二醇产量高，能够耐受高浓度甘油和1，3-丙二醇，且发酵过程能在有氧的条件下等特点，目前已经被广泛应用于1，3-丙二醇的工业生产。

目前利用克雷伯氏肺炎杆菌生产1，3-丙二醇主要存在的问题是1，3-丙二醇对甘油的得率低，副产物多，增加了发酵过程的原料成本。因此，降低副产物的产量，提高1，3-丙二醇的得率对于降低1，3-丙二醇生产成本具有极其重要的意义。目前，文献报道的提高1，3-丙二醇产量和得率的方法都集中在敲除副产物如乙醇、乳酸的合成途径上，还没有文献报道可以通过调控转录因子提高1，3-丙二醇的产量和得率。

PdhR是调控丙酮酸脱氢酶和氧化磷酸化的转录调控因子。2013年，郑庆祥对希瓦氏菌中转录因子PdhR的功能及其调控机制进行了研究，发现PdhR缺失突变株中乙醛酸途径的代谢通量为零，阐明了由于缺乏乙醛酸途径的活性而导致PdhR缺失突变株在以乙酸为惟一碳源的条件下不能生长；进而发现PdhR对于中心碳代谢途径具有双重调控模式：抑制丙酮酸和甲酸代谢相关基因的表达，而激活乙酸代谢基因的表达机制，从而为对希瓦氏菌这类微生物的利用和开发提供理论依据。然而对于克雷伯氏肺炎杆菌中PdhR的具体作用机制，现有技术未见相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种提高1，3-丙二醇的产量和得率的方法。

本发明通过获得一种重组克雷伯氏菌肺炎杆菌发酵甘油从而提高了1，3-丙二醇的产量和得率。

本发明提供的一种PdhR基因失活的重组克雷伯氏菌肺炎杆菌。

优选地，本发明提供的重组克雷伯氏菌肺炎杆菌的PdhR基因敲除或PdhR基因的部分碱基缺失、替换或增加从而导致PdhR基因编码的蛋白功能失活。

进一步地，所述PdhR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示或SEQ ID NO.1所示核苷酸序列缺失、替换或增加一个或多个碱基而保持相同功能的DNA序列。

本发明提供了所述的重组克雷伯氏菌肺炎杆菌的制备方法，包括步骤：

(1)以克雷伯氏菌肺炎杆菌基因组为模板，以SEQ ID NO.2-3所示的引物进行PCR，获得PdhR基因上游的DNA片段；

(2)以克雷伯氏菌肺炎杆菌基因组为模板，以SEQ ID NO.4-5所示的引物进行PCR，获得PdhR基因下游的DNA片段；

(3)以抗生素抗性基因的DNA片段、步骤(1)、(2)获得的DNA片段这三个DNA片段为模板，以SEQ ID NO.8-9所示的引物进行重叠PCR，纯化扩增产物；

(4)重组质粒电转入克雷伯氏肺炎杆菌中，再将步骤(3)获得的扩增产物电转到前述克雷伯氏肺炎杆菌中；

(5)在与步骤(3)抗生素抗性基因相同的抗生素筛选培养基中筛选带抗性的菌株，通过菌落PCR验证正确的重组克雷伯氏菌肺炎杆菌。