[发明专利]一种外源表达BAK1蛋白的方法

说明书

本发明提供了一种外源表达BAK1蛋白的方法。该方法包括步骤：将C端带有6个His标签的BAK1胞外结构域的外显子基因用BamH1和Xho1酶切，采用BamH1和Xho1酶切pFastBac^TM1载体，前述酶切后的产物连接，构建得到外源表达BAK1蛋白的载体；载体转染昆虫细胞，培养该细胞后，收获细胞和上清，上清液经层析，纯化后获得构象正确的BAK1蛋白，表达量达8.6mg/L。本发明方法克服了现有技术采用原核表达系统无法获得正确构象的BAK1蛋白或采用其他真核表达系统BAK1蛋白无法表达的缺点，提高了构象正确的BAK1蛋白的表达量，节约了成本。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体地，涉及一种外源表达BAK1蛋白的方法。

背景技术

植物受体激酶根据胞外识别结构域的不同可以分为很多不同的受体蛋白家族，其中数量最多的研究最为深入的是富亮氨酸重复类受体激酶(leucine-rich repeatsreceptor kinase，LRR-RK)，LRR-RK家族分为16个亚家族。BAK1蛋白属于II家族LRR-RK，615个氨基酸，在植物体内广泛表达，结构组成包括N-端信号肽序列、5个LRR、一个丝氨酸/脯氨酸丰富区、单次跨膜结构域和丝/苏氨酸激酶结构域。

BAK1蛋白是模式植物拟南芥中的受体蛋白激酶，位于细胞表面上，蛋白受体激酶的结构分为一个胞外识别结构域、单次跨膜区和胞内激酶结构域。胞外识别结构域负责识别外源的信号分子，进而激活该受体，引起胞内激酶结构域发生磷酸化，从而将信号由细胞外传递至细胞内，引起细胞内的一系列生化反应。BAK1蛋白是植物识别细菌鞭毛蛋白，植物生长发育调控，花器官脱落等很多生理过程中的共受体，该受体在植物体内的缺失会造成植物对细菌的免疫性下降，导致植物被细菌侵染，植株矮小，功能失调等，过表达BAK1蛋白会提高植物对细菌的耐受性，获得抗病新植株。BAK1蛋白的缺失会导致植物发育不正常，甚至导致植株致死。细菌鞭毛蛋白与BAK1蛋白结合后会激活植物的免疫反应，帮助植物抵抗病菌的入侵，体外获得BAK1蛋白，可以用于筛选新型的小分子药物，筛选出可以激活植物免疫反应的小分子药物，当细菌入侵时，植物可以抵抗细菌的侵害，研制新型抗细菌药物，促进植物的抗病表型并提高植物的产量。

目前的研究内容主要集中在探究BAK1这类受体蛋白的胞外识别结构域是如何识别胞外的信号源识别后被激活的机制。主要手段是通过X射线衍射技术获取蛋白的精细三维结构，在分子水平上阐述上述问题。由于BAK1蛋白只有一个疏水的跨膜区，这对于在体外重组该全长蛋白是一个很大的阻碍。由于蛋白的疏水跨膜区是将细胞膜上的蛋白牢牢锚定在细胞膜上的区域，跨膜区越多，蛋白在细胞膜上越稳定，若跨膜区较多的膜蛋白在体外重组过程中可以采用去垢剂等化学试剂来模拟细胞膜，进而成功获得膜蛋白的体外成功表达，但是对于只有一个疏水跨膜区的蛋白，比如BAK1蛋白，带有跨膜区的全长蛋白在体外表达过程中极不稳定，因此会导致蛋白在体外不表达或者是形成构象不正确的蛋白。因此单次疏水跨膜区极其不利于蛋白在细胞膜上的稳定性，目前可采取的策略是只将BAK1蛋白的胞外区域进行体外扩增并构建到适当的表达载体上，然后获得其稳定构象的胞外结构域的蛋白。

蛋白质大分子在生物体内承担着多种多样的生理功能，研究蛋白质的结构和功能对于人类了解生理调控、机体代谢具有重要意义，但往往需要在体外获取具有正确构象及生理功能的重组蛋白，才能保证一系列研究的顺利开展和实施成功。原核表达系统很大程度地改善了重组外源蛋白表达量不高以及下游分离加工难度大等问题。其中融合蛋白表达技术的表达模式是：原核启动子→SD序列→起始密码子→原核结构基因片断→目的基因序列→终止密码子，是比较常用的表达载体，尤其适用于小分子多肽和蛋白的表达。然而由于BAK1蛋白为大分子真核胞外分泌蛋白，采用原核表达系统外源表达BAK1蛋白往往形成包涵体，不能获得构象正确的蛋白。现有技术采用真核表达系统来生产BAK1蛋白，但都无法获得正确构象的BAK1蛋白。这远远不能满足后续产业对BAK1蛋白的需求。因此，急需一种能够提高BAK1蛋白表达量、成本低廉的方法以弥补现有技术的不足。本方法首次成功地在体外获得正确构象的BAK1蛋白。从无到有的技术突破。

发明内容