[发明专利]马铃薯CISR1基因及其在抗低温糖化中的应用

说明书

本发明提供了马铃薯CISR1基因及其在抗低温糖化中的应用；通过马铃薯基因组数据库中公布的序列，以低温糖化抗性基因型马铃薯“10908‑06”4℃贮藏15d后的块茎cDNA为模板，克隆了CISR1基因，并构建超量表达载体，遗传转化马铃薯鄂薯3号进行转基因功能验证，发现超量表达CISR1基因能够提高其抗低温糖化的能力。

技术领域

本发明属于分子遗传育种领域，具体的说是马铃薯CISR1基因及其在抗低温糖化中的应用。

背景技术

马铃薯是继玉米、小麦和水稻之后的世界第四大粮食作物。在马铃薯油炸加工业中，为了延长加工周期和抑制常温贮藏导致的块茎失水皱缩、病害传播、发芽等现象，常将块茎长期贮藏在低温条件下。但是低温会影响块茎内碳水化合物的代谢，加速淀粉裂解转化为可溶性糖(葡萄糖和果糖)，这种现象称为“低温糖化”。适合油炸加工的马铃薯主要依赖于产品的色泽，而还原糖含量决定了约93％的油炸产品色泽变异。在油炸加工过程中，还原糖与氮化合物的α-氨基酸进行“Maillard Reaction”致使油炸产品表面颜色加深，严重影响加工品质。更严重的是，“Maillard Reaction”反应过程中还形成丙烯酰胺。丙烯酰胺是一种潜在的致癌物，对人体具有神经和遗传毒性的影响，引起世界范围内食品安全的关注。耐低温糖化马铃薯油炸加工品种匮乏严重阻碍了加工业的快速发展。减少还原糖含量不仅能够减低丙烯酰胺含量，而且还能解决加工产品色泽问题，是改良马铃薯加工品质的一个有效途径。

现有技术存在的问题：根据RNA-seq数据及共表达实验筛选出CISR1转录因子，目前，关于CISR1在马铃薯块茎低温糖化代谢过程中的作用并无相关文献报道。

发明内容

鉴于现有技术的不足，本发明提供了马铃薯CISR1基因及其在抗低温糖化中的应用；通过马铃薯基因组数据库中公布的序列，以低温糖化抗性基因型马铃薯“10908-06”4℃贮藏15d后的块茎cDNA为模板，克隆了CISR1基因，并构建超量表达载体，遗传转化鄂马铃薯3号进行转基因功能验证，发现超量表达CISR1基因能够提高其抗低温糖化的能力。

为了达到上述目的，本发明采用了如下的技术方案：

马铃薯RNA-seq分析与低温糖化基因筛选：

本发明选取了低温糖化抗性基因型“10908-06”和低温糖化敏感基因型“鄂马铃薯3号(E3)”，种植于温室。马铃薯块茎收获后，室温遮光放置10天，选单个薯块重量大于50g、无病虫害和无机械损伤的块茎，分为两份，一份20℃贮藏0d、5d、15d，另一份4℃贮藏5d、15d，分别取样。取样时将块茎去皮切成小块速冻于液氮，保存于-70℃。参照天根生化科技(北京)有限公司(DP441)多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取上述所取样品的RNA，送于华大基因进行转录组测序(参考CN201510010458.X、CN201010213759.X、CN201610639522.5)。分析低温糖化抗性和敏感基因型贮藏块茎低温应答的表达谱数据，发现CISR1在抗感材料中的表达模式不一致，表达谱数据结果如下表所示(基因的表达量单位为FPKM)。

马铃薯CISR1基因，其通过如下步骤克隆得到：

(1)引物设计

根据马铃薯基因组序列信息(PGSC0003DMG400016812)，用SnapGene2.3.2软件设计扩增该基因CDS序列的引物。

(2)RNA提取与反转录

参照天根(DP441)多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取低温糖化抗性基因型马铃薯10908-06 4℃贮藏15d后的块茎RNA，根据TOYOBO反转录试剂盒(Code No.FSQ-101)进行反转录获得cDNA。

(3)PCR反应、克隆载体构建和测序