[发明专利]基于双振镜双物镜的三维结构光照明超分辨显微成像装置和方法

权利要求书

1.一种基于双振镜双物镜的三维结构光照明超分辨显微成像装置，包括发出激光光束的激光器，其特征在于，还包括：

分束组件，具有沿激光器的光路依次布置并将激光光束分成六束的三个分束镜，六束激光光束分为两组照明光分别从样品台对称的两侧入射；

扫描振镜组，分别安装在前两个分束镜的反射光路上，其中一个反射光路上设有通过移动来改变光程差的反射镜；

显微物镜组，分别位于所述两组照明光的光路上，两个显微物镜分别从样品两侧将光束聚焦于同一焦平面形成干涉产生三维结构光照明，并收集样品发出的荧光信号；

所述分束组件中的最后一个分束镜与两个显微物镜之间的光程长度一致；

还包括一计算机处理器，用于控制所述反射镜移动以及振镜扫描进行扫描，使结构光照明图样进行多次相移和方向旋转，控制样品台进行纵向扫描，获取不同深度处不同照明方向上不同相位的二维超分辨图像，并对所有二维超分辨图像进行三维叠加，获取样品的三维超分辨图像。

2.根据权利要求1所述的三维结构光照明超分辨显微成像装置，其特征在于：位于所述激光器的光路上的最后一个分束镜将由前两个分束镜分成的一路透射光和两路反射光再分成六束光，最后一个分束镜兼做合束器，对由所述的两个显微物镜收集到的荧光信号进行合束，合束后的荧光由相机收集。

3.根据权利要求2所述的三维结构光照明超分辨显微成像装置，其特征在于：所述的最后一个分束镜与所述的相机之间设有二向色镜，用于滤除入射激光信号的干扰。

4.根据权利要求1所述的三维结构光照明超分辨显微成像装置，其特征在于：所述的反射镜有压电陶瓷驱动进行移动，该压电陶瓷根据所述的计算机处理器发出的信号，改变入射光路的光程差使结构光照明图像产生相移。

5.根据权利要求1所述的三维结构光照明超分辨显微成像装置，其特征在于：所述的计算机处理器控制所述的反射镜至少移动五次，得到至少五幅相移后的荧光强度图像；

计算机处理器控制所述的扫描振镜对样品进行扫描，使得投射到样品上的结构光图样至少具有三个不同角度的方向旋转，得到不同角度下的荧光强度图像；

计算机处理器控制所述的样品台的纵向扫描步距在50纳米以下，扫描次数为10次。

6.根据权利要求1所述的三维结构光照明超分辨显微成像装置，其特征在于：所述的激光器与分束组件间依次放置有对激光光束进行滤波的单模光纤以及对激光光束进行准直、缩束和扩束的光束准直器。

7.根据权利要求1所述的三维结构光照明超分辨显微成像装置，其特征在于：所述的扫描振镜采用反射式、透射式、共振式、单镜式或双镜式结构。

8.一种基于双振镜双物镜的三维结构光照明超分辨显微成像方法，采用如权利要求1～7中任一权利要求所述的三维结构光照明超分辨显微成像装置实现，其特征在于，包括以下步骤：

1)将激光光束分为六束沿不同方向传播的入射光，六束光分为两组，经过两个光程长度一致的光路分别从样品两侧入射，并通过设置在两光路上的显微物镜使两组入射光在同一焦平面处发生干涉，形成三维结构光照明图样；

2)三维结构光照明图样激发样品产生的荧光信号被两侧的显微物镜收集，汇聚到相机上发生荧光自干涉；

3)获取同一照明方向下的多幅不同相位的荧光强度图像；

4)旋转照明图样的方向，同时在每个方向下重复步骤3)，获取不同照明方向下不同相位的荧光强度图像；

5)控制样品台进行纵向扫描，获取样品的三维深度信息，同时在每个深度处重复步骤3)和4)；

6)对每个深度处获取的荧光强度图像进行后期算法重构，获取相应深度处的二维超分辨图像；

7)对所有二维超分辨图像进行三维叠加，最终获取样品的三维超分辨图像。

9.根据权利要求8所述的三维结构光照明超分辨显微成像方法，其特征在于：步骤3)中至少获取五幅相移后的荧光强度图像；步骤4)中照明图样的方向至少旋转三次；步骤5)中样品台的纵向扫描步距在50纳米以下，扫描次数为10次。