[发明专利]柑橘衰退病毒微滴数字PCR定量检测试剂盒及方法在审
申请号: | 201811285052.2 | 申请日: | 2018-10-31 |
公开(公告)号: | CN109321680A | 公开(公告)日: | 2019-02-12 |
发明(设计)人: | 周彦;王瑛丽;杨真;王琴;刘莹洁 | 申请(专利权)人: | 中国农业科学院柑桔研究所 |
主分类号: | C12Q1/70 | 分类号: | C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11 |
代理公司: | 重庆市前沿专利事务所(普通合伙) 50211 | 代理人: | 邹晓艳 |
地址: | 400712 重*** | 国省代码: | 重庆;50 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 微滴 柑橘衰退病毒 数字PCR 定量检测试剂盒 灵敏度 试剂盒 总RNA 总RNA提取试剂 检测灵敏度 逆转录反应 转录 定量检测 特异性强 体外转录 抽提 扩增 引物 合成 检测 | ||
1.一种柑橘衰退病毒微滴数字PCR定量检测试剂盒,其特征在于:包括总RNA提取试剂,引物CTV7、CTV6F和CTV6R,T7体外转录试剂盒,QX200 ddPCR EvaGreen supermix试剂盒,所述CTV7、CTV6F和CTV6R引物序列为:
CTV7:5′-TAATACGACTCACTATAGGGTCCGACTCTGATAACGATG-3′,
CTV6F:5′-TCCGACTCTGATAACGATG-3′,
CTV6R:5′-ACCGCTAAACGATACAAC-3′。
2.一种柑橘衰退病毒微滴数字PCR定量检测方法,其特征在于:利用权利要求1所述的检测试剂盒进行,包括如下步骤:
(1)取待测植株的叶片,抽提总RNA;
(2)以提取的总RNA为模板,用引物CTV7和CTV6R扩增总RNA,扩增产物纯化后,用T7体外转录试剂盒转录合成cRNA,利用特异性引物CTV6R对cRNA进行逆转录反应,获得cDNA;
(3)以步骤(2)制得的cDNA为模板,利用特异性引物CTV6F和CTV6R进行微滴数字ddPCR检测。
3.如权利要求2所述的柑橘衰退病毒微滴数字PCR定量检测方法,其特征在于:所述步骤(3)中微滴数字ddPCR检测的扩增条件为:95℃5min;95℃30s,56℃30s,40个循环;4℃5min;90℃5min;4℃90min;每秒降低2℃。
4.如权利要求2或3所述的柑橘衰退病毒微滴数字PCR定量检测方法,其特征在于:所述步骤(3)中ddPCR反应体系总共为20μL:2μL模板cDNA、浓度均为200nmol·L-1的引物CTV6F、CTV6R各0.4μL、10μL 2×QX200 ddPCR EvaGreen supermix、余量为ddH2O。
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