[发明专利]呼肠弧病毒家族病毒的疫苗病毒株的制造方法

说明书

本发明涉及作为呼肠弧病毒科家族成员的病毒的改良病毒株的制造方法，以及尤其涉及环状病毒属的疫苗病毒株。

本申请是2008年11月26日申请的PCT国际申请PCT/GB2008/003945 于2010年7月26日进入中国国家阶段的、申请号为200880125535.4且发明名称为“呼肠弧病毒家族病毒的疫苗病毒株的制造方法”的发明专利申请的分案申请。

本发明涉及产生病毒的改性病毒株的方法，该病毒为呼肠弧病毒家族成员，尤其涉及尤其涉及环状病毒属的疫苗病毒株。

呼肠弧病毒科(Reoviridae)病毒，其具有由双股RNA(dsRNA)构成的基因组，导致多种疾病。环状病毒为呼肠弧病毒家族病毒，也导致广泛传播的疾病。环状病毒的实例为非洲马瘟病毒(AHSV)、流行性出血热病毒(EHDV)及蓝舌病毒(BTV)。

非洲马瘟病毒(AHSV)、流行性出血热病毒(EHDV)及蓝舌病毒 (BTV)为反刍动物的非接触传染的病毒性疾病，并通常经昆虫携带者传播。AHSV通常地感染马、骡、驴及斑马；EHDV通常地感染鹿、家牛及绵羊；及BTV通常地感染家牛、绵羊、山羊、水牛、鹿、单峰骆驼及羚羊。

蓝舌病毒(BTV)为昆虫媒介的野生反刍动物及家畜的新兴病原体，其对欧洲农业已经产生严重的经济影响。BTV导致绵羊、山羊及家牛疾病，在一些种的绵羊中死亡率达70％。BTV在哺乳动物宿主间通过库蠓属的几种蠓传播，该蠓决定了该病毒的地理范围。BTV在多个热带及亚热带国家为地方性的，但自1998年BTV入侵欧洲大陆已经成为常见的事件，并于 2007年向北直至联合王国。分子流行病学研究显示自1998年六种不同血清型(BTV1、2、4、8、9及16)在至少八个独立的场合，通过至少三种不同渠道已被引入欧洲大陆，自1998年大多数年份都有新的引入。BTV 的所述增加范围的可能直接原因为昆虫媒介种群的大小和分布的增加， BTV通过新媒介种类的传播，其在中欧及北欧大量存在。家畜或野生反刍动物未确诊感染的存在与通过昆虫媒介的迁徙而远距离迅速传播一起导致阻止BTV在欧洲开始地方性化的失败。因此，当前BTV对所有欧洲国家中的家畜表现出严重威胁。四种BTV血清型现在欧洲普遍存在，并已导致180万头动物的死亡。

在欧洲已经尝试了通过接种进行BTV控制，其对少数的血清型同时使用活的和灭活的疫苗。两种疫苗已为欧洲各地区提供了一些保护，但仍有已知的缺点。存活的减低毒性的BTV疫苗具有多种缺点：1)导致典型蓝舌临床症状的发生的under-attenuation；2)毒性恢复或与野生型病毒重组，之后通过昆虫媒介传播；3)不能区分接种疫苗的动物与自然地感染的动物，这妨碍了鉴别感染与接种动物策略(DIVA)的使用；以及4)制造新流行的血清型的毒性降低株的时间延迟。

在欧洲，灭活疫苗已被用于控制BTV2及BTV4。这些疫苗受与灭活、确认每一批已灭活以及低免疫原性相关的高制造成本影响。

此前发明人已报道了BTV ssRNA在不使用辅助病毒时仍然是有感染性的，同时有感染性的BTV可从细胞中回收(Boyce,M.和Roy,P.2007)。此文献以全文方式结合于本文。

本发明旨在减少或消除与改良病毒的病毒株相关的，尤其是与产生活的减低毒性的疫苗相关的部分或全部已知缺点，所述病毒为呼肠弧病毒家族的成员。

本发明提供了制造作为呼肠弧病毒家族成员的病毒的疫苗病毒株的方法，该方法包括：

在呼肠弧病毒科病毒中引入突变，从而摧毁必需基因的功能；

使用来自病毒基因组并包含所述突变的病毒单股RNA(ssRNA)转染细胞；

在适宜的条件下培养该被转染的细胞，以实现疫苗病毒株的制造，

其中所述细胞补充了必需病毒基因的功能，因此使得疫苗病毒株在细胞中复制。