[发明专利]一种产生4-O-去甲基巴尔巴地衣酸的土曲霉菌株极其应用

权利要求书

1.一种4-O-去甲基巴尔巴地衣酸的土曲霉菌株在发酵生产4-O-去甲基巴尔巴地衣酸中的应用，其特征在于：所述4-O-去甲基巴尔巴地衣酸的土曲霉菌株为土曲霉（Aspergillus terreus）MEFC06，已于2018年6月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为：CGMCC No.15890；

所述应用包括以下步骤：

（1）土曲霉菌种种子液制备，种子液接种到发酵培养基中发酵培养；所述种子液制备，具体为：将土曲霉MEFC06接种到PDA平板培养基上，28℃培养4-9天；将PDA平板上的孢子接种到种子培养基中，接种量为10⁶-10⁸个/35mL，28℃、220rpm摇床培养1-5天，得到种子液;

种子液接种到发酵培养基的接种量为按二者体积比3:35；步骤（1）中所述发酵培养，发酵温度为28℃，220rpm摇床培养6-12天，并在第4天向发酵培养体系中补加质量分数50%葡萄糖溶液，原发酵体系体积为补加的葡萄糖溶液体积的9倍;

（2）发酵液分离纯化得到4-O-去甲基巴尔巴地衣酸；所述分离提纯，具体为：菌体与发酵液分别用不同的有机溶剂萃取，合并所有有机相，浓缩有机相获得粗提物，粗提物采用硅胶柱层析分离得到洗脱液，洗脱液重结晶得到4-O-去甲基巴尔巴地衣酸;

所述将菌体与发酵液分离的方法为：采用200目的尼龙布过滤，取滤液为发酵液，取滤渣为菌体;

所述菌体萃取为：菌体用二氯甲烷/甲醇混合有机溶剂浸泡，超声萃取，分离有机相，剩余菌体重复上述操作两次，合并有机相；所述二氯甲烷/甲醇混合有机溶剂中，二氯甲烷与甲醇的体积比为1:1；所述超声萃取，超声频率为40kHz-100kHz，每次超声萃取时间为1-30min；每次超声萃取，混合有机溶剂与菌体的比例为(5-500)mL:(1-5)g;

所述发酵液萃取为：菌液与乙酸乙酯混匀，静置分层，分离有机相，剩余水相重复上述操作两次，合并有机相;

所述硅胶柱层析具体为：粗提物与硅胶按质量比1:(5-10)拌样，然后与200-300目的硅胶按高度比1:(3-5)装柱过减压硅胶柱层析，洗脱剂为乙酸乙酯：石油醚体积比1:9，洗脱剂中含有体积分数为0.1%的甲酸或三氟乙酸，洗脱量为3-5个柱体积，洗脱剂流速为5-20ml/min;

所述重结晶具体为：所得洗脱液在40℃条件下减压蒸馏浓缩至过饱和状态，冰浴冷却，结晶后过滤，滤饼用二氯甲烷冲洗3-4次，30℃干燥。