[发明专利]一种酸性多糖中单糖组成的测定方法

说明书

本发明提供了一种测定酸性多糖中单糖组成的方法，检测方法步骤包括：(1)通过弱酸对多糖进行第一步水解，之后配合强酸进行第二步水解；(2)通过离子色谱结合电化学检测器测定水解样品中的单糖组成。所述第一步水解中的弱酸为摩尔浓度较低的三氟乙酸，第二步水解中的强酸为摩尔浓度较高的硫酸。根据所获得的离子色谱图谱，基于峰迁移时间和峰面积可得到单糖的种类和含量。与传统的一步水解法相比，本方法精确度高，选择性好，适用于酸性多糖的单糖组成分析。

技术领域

本发明涉及天然产物来源多糖种的单糖组成分析，具体涉及一种天然产物来源酸性多糖中单糖组成分析。

背景技术

多糖是指由超过10个的单糖以糖苷键连接而成的高分子聚合物，通常存在于动物细胞、高等植物细胞及部分微生物细胞壁中，是生命体的重要组成部分，也是维持机体生命活动必不可少的化合物。多糖生物活性与其结构关系密切，而其单糖组成是结构基础。

在多糖的单糖组成分析过程中，涉及水解单糖、分离及检测等过程，其中将多糖水解成游离的单糖是非常重要的一个步骤，目前常用的方法有酸水解、碱水解、酶催化降解及物理降解等。碱催化降解反应只能从多糖链的还原末端逐个脱落出单糖，反应速率较慢，并且在水解过程中时常伴随着产物结构的变化，因此目前碱水解技术尚无法满足将多糖水解为单糖的需要。酶催化降解可以选择性地水解不同的糖苷键，并且反应速率快，但是酶的高度专一性导致在实际应用中很难找到与底物相契合的酶，酶催化降解对温度、pH等环境有较多要求，因此酶催化降解在多糖水解为单糖的实际应用中有诸多限制。物理降解技术包括有微波、辐射、超声波等，但这些物理手段通常很难使多糖完全降解为单糖，通常作为一种辅助手段。

酸水解是指溶液中的氢离子使糖苷键上的氧原子质子化从而导致糖苷键断裂的过程，酸水解反应可以发生在多糖链的任一糖苷键中，具有反应速率快、水解产物结构变化小等优点，是多糖水解为单糖的主流技术。酸水解常用的酸有盐酸、硫酸、三氟乙酸等，在多糖被水解成为单糖过程中，往往会伴随部分单糖的损失，尤其是中性糖和氨基糖，导致无法准确测定多糖中的单糖组成，对于酸性多糖中，由于糖醛酸难以被水解，要在尽量减少中性糖的损失的情况下，水解出更多的糖醛酸，从而准确测定出酸性多糖中单糖组成。目前，针对酸性多糖的单糖组成测定，常用的方法有单种类酸水解，也有人采用综合的方法优化水解效果，如孙元琳等报道一种当归果胶多糖中的糖醛酸含量测定方法(中国食品学报,2008,8:128-132)，认为多糖需经脱脂处理并结合弱酸水解和酶解才能得到准确、真实的结果，De Ruiter等(Analytical biochemistry,1992,207(1):176-185)发现甲醇解结合三氟乙酸对含糖醛酸类多糖的水解效果较好。但是，孙元琳等人报道的方法需要对多糖进行脱脂特殊处理，同时要选择特异性酶的方法处理，步骤较为繁琐且成本较高；而De Ruiter等所推荐的方法，需要将甲醇溶解在盐酸中，处理工艺特殊、复杂。因此，需要对富含糖醛酸多糖水解进行进一步优化。

发明内容

发明目的：为克服传统水解方法的不足，本发明提供了一种新的一种酸性多糖单糖中组成的测定方法，尤其是提高多糖中单糖水解效率。

本发明具体技术方案如下：

一种酸性多糖单糖中组成的测定方法，包括以下步骤：

(1)多糖水解：称取5mg多糖，加入3mL三氟乙酸溶液加热进行第一步水解，反应结束后再冷却，之后加入3mL摩尔体积浓度(mol/L)为2的硫酸进行第二步水解，于100℃水解时间2h，水解完成后将样品溶液转移至250mL容量瓶定容，取稀释后的水解样品溶液并用0.22μm水系微孔滤膜过滤，取滤液用离子色谱仪分析。

(2)检测条件：所述离子色谱仪为DIONEX ICS-5000，柱子采用DIONEX公司的CarboPac^TM PA20分析柱(3mm×150mm)，柱温箱温度为30.0℃；检测系统为电化学检测器(25.0℃)，流动相由摩尔体积浓度(mol/L)为0.25的氢氧化钠溶液、摩尔体积浓度(mol/L)为1的醋酸钠溶液和超纯水组成，梯度洗脱。