[发明专利]银杏内生真菌的分离筛选方法

说明书

本发明公开了一种银杏内生真菌的分离筛选方法，采集银杏根、茎、叶、果肉、果仁；将银杏组织经表面消毒后，培养，从中选出表面无任何菌种生长的组织；将无菌组织在无菌条件下切割成小片移植于PDA培养基上，置28℃恒温箱培养，至样品周围长出菌丝时，挑取形态不同的菌落，经纯化后转接到PDA斜面培养基备用；将液体发酵培养基分装在三角瓶中，用接种钩挑取少许分离纯化的内生真菌菌丝于培养瓶中培养，取发酵上清液；取上清液与冷却至50℃的PDA培养基于无菌培养皿内，放供试菌饼，计算各菌株发酵液对供试病原菌的抑制率；筛选出的高效抑制率内生真菌菌株进行保藏备用。

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及从银杏组织中分离筛选出，经发酵能产生抑制植物真菌病害病原菌代谢产物的内生真菌的方法。

背景技术

银杏(Ginkgo biloba L.)又名白果，是我国特有的世界珍稀名贵树种，是冰川运动遗留的孑遗植物，被称为活化石。属银杏科，是银杏属现存的唯一生存种。现为广泛栽培树种，具有极高的研究开发价值。银杏各组织含有抑菌物质，据报道，银杏根、茎、叶、果肉(外种皮)及果仁的提取物对供试的植物病原菌有抑制作用。但植物资源量是限制植物源杀菌剂发展规模的主要因素之一。但从银杏中分离筛选内生真菌，并通过发酵获得对植物真菌病害病原菌具有抑制作用的代谢产物，这在国内外还未见有研究报道。

发明内容

本发明目的是提出一种从银杏组织中，分离筛选出其代谢产物对植物真菌病害病原菌有明显抑制作用的内生真菌的方法，以达到由微生物发酵法取代从植物中提取杀菌活性物质的传统方法。

本发明的目的通过以下技术方案得以实现。

一种银杏内生真菌的分离筛选方法，该方法包括以下步骤：

(1)采集银杏根、茎、叶、果肉、果仁；

(2)将步骤(1)银杏组织经表面消毒后，直接种植于PDA培养基平皿上，置26℃～28℃恒温箱培养，从中选出表面无任何菌种生长的组织；

(3)将步骤(2)的无菌组织在无菌条件下切割成小片移植于PDA培养基上，置28℃恒温箱培养，至样品周围长出菌丝时，采用尖端菌丝挑取法，挑取形态不同的菌落，经纯化后转接到PDA斜面培养基备用；

(4)其各组分与每升所含的质量为蛋白胨0-5.5g、玉米粉1-8g、麸皮0-10g、可溶性淀粉0-10g、葡萄糖1-8g、黄豆饼粉1-9g、CaCO₃0.5-2.5g、NH₄NO₃0.1-1.2g、MgSO₄0.1-0.9g、KH₂PO₄0.1-0.9g；

(5)将步骤(4)液体发酵培养基分装在三角瓶中，用接种钩挑取少许经步骤(3)分离纯化的内生真菌菌丝于培养瓶中，置28℃摇床，200r/min，振荡培养4天，发酵液经5000r/min离心10min，取发酵上清液；

(6)取步骤(5)各上清液与冷却至50℃的PDA培养基按毫升体积1∶9混匀于无菌培养皿内，凝固后在每个培养基平面放1个直径为4mm的供试菌饼，置28℃培养箱培养后，计算各菌株发酵液对供试病原菌的抑制率；

(7)将步骤(6)筛选出的高效抑制率内生真菌菌株进行保藏，备用。

本发明的有益效果，一是本发明根据“内共生理论”从银杏中筛选出其代谢产物与宿主植物提取物相同或相似的，对植物真菌病害病原菌具有抑制作用的内生真菌，这为实现由植物中提取杀菌活性物质到微生物发酵法生产杀菌活性物质的转化，提供了有效的菌种分离筛选方法；二是本发明跟踪测定了分离到的各内生真菌菌株代谢产物对供试植物病原菌的抑制作用，从而获得有效菌株，为微生物农药的进一步研制和开发提供了一批出发菌株；三是本发明重视了对植物组织的前期无菌检测，并研制了银杏内生真菌适用的液体发酵培养基，提高了对内生真菌分离筛选的成功率与效率。