[发明专利]DNA甲基转移酶及其可溶性异源表达和分离纯化方法有效
| 申请号： | 201811291824.3 | 申请日： | 2018-10-31 |
| 公开（公告）号： | CN109486779B | 公开（公告）日： | 2020-07-24 |
| 发明（设计）人： | 华跃进;李胜杰;王梁燕;蔡建玲 | 申请（专利权）人： | 浙江大学 |
| 主分类号： | C12N9/10 | 分类号： | C12N9/10;C12N15/54;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19 |
| 代理公司： | 杭州求是专利事务所有限公司 33200 | 代理人： | 林松海 |
| 地址： | 310058 浙江*** | 国省代码： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | dna 甲基转移酶 及其 可溶性 表达 分离 纯化 方法 | ||
1.一种DNA甲基转移酶的可溶性异源表达方法，其特征在于，
所述方法的步骤为：
1）将包含所述DNA甲基转移酶的核苷酸序列的重组原核表达载体pET28a-HMT转化原核表达宿主细胞E.coli ER2566；所述DNA甲基转移酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
2）将转化后的原核表达宿主细胞活化2次，扩大培养至O.D.600 0.6，冰水浴冷却，无菌加入0.4 mM IPTG，16 ℃，220 rpm诱导培养20 h；
3）诱导培养后离心收集菌体，菌体中加入裂解Buffer悬浮细胞，将悬浮的细胞先在4℃、800-1200 bar条件下高压破碎2-4 min；再在冰水浴中，用功率60%、超声3s和间隙9.9 s超声破碎60-90 min；最后低温高速离心30-50 min，收集上清；所述裂解buffer为20 mMTris-HCl pH 7.8-8.0、50-500 mM NaCl和3mM β-Me。
2.如权利要求1所述的DNA甲基转移酶的可溶性异源表达方法，其特征在于，进一步，将收集的上清进行DNA甲基转移酶的分离纯化，步骤依次为：镍柱亲和层析纯化，TEV蛋白酶酶切去除标签，MBP柱纯化，脱盐柱脱盐，镍柱进一步亲和层析纯化，免疫印迹鉴定，脱盐柱再脱盐，Heparin柱纯化，分子筛Superdex 75纯化。
3.如权利要求2所述的 DNA甲基转移酶的可溶性异源表达方法，其特征在于，进一步进行质谱鉴定，酶活性分析。
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