[发明专利]一种高效分离脐带胎盘间充质干细胞的方法及应用

权利要求书

1.本发明建立一种高效分离培养脐带、胎盘干细胞的方法：A.取材安全；B.冷链运输，全程监控，安全运输；C.进一步处理组织，挑选好的部位；D.组织消化液分散细胞；E.筛网过滤细胞，密度梯度离心进一步提纯细胞，保留组织块；F.用添加胎盘组织液的MSC培养基，37℃，5% CO2培养箱培养；G.传代或冻存细胞；H.质量安全、生物学效力检测，保障培养安全、细胞纯度及增殖分化能力。

2.根据权利要求1的方法，其步骤A，所用脐带、胎盘可以是人自然分娩或剖腹产后废弃的胎盘；产妇必须经过健康体检，无遗传病、感染性疾病或携带者，以及其他疾病，严格无菌操作；脐带、胎盘必须新鲜（0-2小时内）。

3.根据权利要求1的方法，其步骤B,将脐带、胎盘表面的血渍初步清洗干净，清洗液可以是含有青链霉素和咪康唑的生理盐水；脐带、胎盘全程冷链运输，全程监控，安全运输指将胎盘放入脐带、胎盘保存液中，低温冷链全程监控快速运输到实验室，即到即处理（0-72小时），提高安全等级，做到安全效率。

4.根据权利要求1的方法，其步骤C，用含有青链霉素和咪康唑的PBS溶液冲洗脐带、胎盘组织，洗去残留的保存液和血渍，最后一次用纯净的PBS冲洗，选取质量较好部分，剥离组织块，这样保证我们培养的细胞更加安全、活力高。

5.根据权利要求1的方法，其步骤D,将组织块进一步切割成1-3mm3大小浸润在新的PBS溶液中，不含抗生素和胎牛血清，避免造成残留，组织消化液37℃摇床，b.室温静置；c.2-8℃静置冷消化，多元化消化处理，样本再多，一样可以保证效率。

6.根据权利要求5的方法，组织消化液指以下一种或几种成分：胰蛋白酶、胶原酶Ⅱ、Ⅳ、分散酶、EDTA，比单一酶消化效率高。

7.根据权利要求6的方法，各种酶的浓度可以是：胰蛋白酶0.05-0.25%，胶原酶Ⅱ0.05-0.3%，胶原酶Ⅳ0.05-0.3%，分散酶0.1-2.4u/ml，EDTA0.005-0.1%。

8.根据权利要求1的方法，其步骤E，消化液经筛网过滤，PBS冲洗，去除杂细胞，挑选单细胞，进一步提纯可以用羟乙基淀粉离心法也可以用Ficoll离心法；未完全消化的组织块不研磨，用PBS重悬，一起离心，避免研磨对细胞造成更大的损伤。

9. 根据权利要求1的方法，其步骤F，用添加胎盘组织液的无血清培养基；胎盘组织液含有多种因子，正是胎盘细胞原始的生长环境，将细胞和组织块分瓶，37℃，5% CO2培养箱培养，缩短培养时间。

10.根据权利要求9的方法，待细胞瓶组形成克隆后，胰酶消化，以一定密度重铺或作传代处理，组织块瓶组克隆消化处理，剩余组织块半量换液重贴，既不浪费培养基也利于细胞增殖。

11.根据权利要求1的方法，其步骤G，克隆增多，选择传代或冻存处理，每一次操作完成都对样本进行安全监测。

12.根据权利要求1的方法，其步骤H，对细胞进行生物安全、生物学效力及表型检测，并做数据归档，从源头到结束全部保证安全、有条理。