[发明专利]一种spo11基因的敲除方法

说明书

本发明公开了一种spo11基因的敲除方法，利用CRISPR/Cas9技术对减数分裂相关基因spo11进行敲除。通过本发明的方法，通过敲除spo11基因，继而可以特异性获得雄性不育个体，可以通过建立敲除家系。

技术领域

本发明涉及一种spo11基因的敲除方法，属于分子生物学领域。

背景技术

spo11是Ⅱ型拓扑异构酶的同源蛋白，参与DNA双链断裂复合物（DSBs）的形成，在减数分裂同源重组的发生中发挥重要功能。在大多数有性生殖的生物的减数分裂中，重组扮演着至关重要的角色，它是遗传多样性的重要来源，能够产生单倍体的配子，同时姐妹染色单体交叉互换也增加了配子的多样性。发明人在多年的实验中，发现敲除一个减数分裂相关基因spo11，导致斑马鱼雄性特异性不育，雌性几乎不受影响，而目前还没有人报道基因spo11具有这种功能。

发明内容

针对上述现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种spo11基因的敲除方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：spo11基因的敲除方法，其特征在于，利用CRISPR/Cas9技术对减数分裂相关基因spo11进行敲除，具体操作如下：

（1）通过ensembl在线数据库查找斑马鱼spo11基因组序列no:ENSDART00000005373.9,在该基因第一个外显子上设计敲除靶位点，靶位点序列为SEQ ID NO：1：TGGAAACGGTCGACAGATGCCAGG；

（2）按常规方法检测靶位点是否存在单核苷酸多态性；

（3）gRNA的获得：

以gRNA-plasmid为模板，以gRNA-F/gRNA-R为引物，gRNA-F的序列为SEQ ID NO：2：TAATACGACTCACTATAGGGTGGAAACGGTCGACAGATGCCGTTTTAGAGCTAGAAATAAG；gRNA-R的序列为SEQID NO：3：AGCACCGACTCGGTGCCACT,利用KOD Plus（TAKARA）高保真酶进行PCR扩增，扩增产物割胶回收，回收产物连接pMD18-T载体(TAKARA)后转化感受态大肠杆菌，挑取5个大肠杆菌单克隆扩大培养后提取质粒DNA，然后质粒DNA测序进行序列验证，序列正确克隆扩大培养后提取质粒DNA作为下一步转录gRNA的模板；再利用MEGAscript® T7 Transcription Kit(Invitrogen^TM)将构建好的含有spo11靶序列的质粒体外逆转录20ｕl反应体系如下：

10x Reaction Buffer 2ｕl；

Plasmid DNA 4ｕl (约1ｕg）；

T7 Enzyme 2ｕl；

10mmol/L NTP 1ｕl；

DEPC water 11ｕl；

以上体系37℃反应一个小时后纯化备用；

（4）体外转录获得Cas9 mRNA ：

Cas9质粒来自Addgene^TM(#63154),使用MAXIscript®T7/T3 Transcription Kit(Invitrogen^TM),合成Cas9 mRNA，体系及反应条件同步骤3；

（5）Cas9 mRNA和gRNA显微共注射：首先配置显微注射体系如下：

Cas9 mRNA 300 ng/ｕl；

gRNA 30ng/ｕl；

Phenol-red 0.2ｕl；