[发明专利]一种胚胎培养液及一种体细胞克隆胚胎的处理方法

权利要求书

1.一种胚胎培养液，其特征在于，其组成成份及其含量分别为:

NaCl 108 mM；

KCl 10 mM；

KH₂PO₄ 0.35 mM；

MgSO₄·7H₂O 0.40 mM；

NaHCO₃ 25.07 mM；

Na-pyruvate 0.20 mM；

Ca-(lactate)2·5H₂O 2.00 mM；

L-Glutamine 2.00 mM；

Hypotaurine 5.00 mM；

EAA 20.00 mL/L；

NEAA 10.00 mL/L；

BSA 4.00 mg/mL；

LAQ824 200 nM；

其中，所述的LAQ824为如结构式（1）所示的化合物：

（1）。

2.一种猪体细胞克隆胚胎的处理方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、激活核移植重构胚；

S2、转入权利要求1所述的胚胎培养液中培养24h；

S3、更换为如权利要求1中所述的除LAQ824成份外的含有其他组成成份的培养液，继续培养至168h。

3.根据权利要求2所述的体细胞克隆胚胎的处理方法，其特征在于，所述S1步骤包括：将卵母细胞使用显微操作仪去除极体及附近约15%的胞质，然后使用荧光染料染色2min，并在荧光显微镜下观察，废弃未完全去掉核的卵母细胞，在去除完全的所述卵母细胞的卵周隙注入一个供体细胞完成重构胚胎，所述重构胚胎放入电融合液后，使用85v/mm、60μs、2次脉冲将所述重构胚胎融合，然后将所述重构胚胎转移到如权利要求1中所述的除LAQ824成份外的含有其他组成成份的培养液中孵育1h，挑选融合的所述重构胚胎使用80v/mm、80μs、2次脉冲直流电进行激活。

4.根据权利要求3所述的体细胞克隆胚胎的处理方法，其特征在于，所述卵母细胞通过以下方式采集：

从屠宰场母猪获取的卵巢，放入37℃生理盐水内运回实验室，使用添加抗生素的生理盐水冲洗3遍后，用配有18G针头的10mL注射器抽取2-6mm的卵泡，在体视显微镜下用自制捡卵针捡取卵丘-卵母细胞复合体，用洗卵液洗3遍后，再用成熟培养液洗2遍，然后放入已在CO₂培养箱内平衡4h以上的成熟培养液中，在39℃、5%CO₂、饱和湿度的培养箱中成熟培养44h；将成熟培养后的卵丘-卵母细胞复合体与0.1%透明质酸酶混合，用移液枪反复吹打除去卵丘细胞，去除卵丘细胞的卵母细胞挑选出卵周隙明显且无杂质、胞质均匀、明显排出第一极体的卵母细胞进行克隆胚胎的构建。

5.根据权利要求3所述的体细胞克隆胚胎的处理方法，其特征在于，所述供体细胞通过以下方式采集：

剪取猪耳皮后放入DMEM培养液4℃保存运回实验室，将猪耳皮组织块剪碎后，用DMEM清洗组织碎片后用适量胎牛血清重悬并转移到培养皿中，37℃、5%CO₂、饱和湿度环境中培养5-7h后，添加含10%胎牛血清的DMEM培养液，待细胞长至90%汇合时进行传代，用传至第2代的体细胞作为核移植的供体细胞。